HIV-1近全长基因组的扩增引物组和测序方法技术

本发明专利技术公开了一个用于HIV

【技术实现步骤摘要】
HIV
‑
1近全长基因组的扩增引物组和测序方法


[0001]本专利技术涉及生物
具体地，本专利技术涉及用于扩增HIV
‑
1基因组的引物组、相关的扩增和测序方法及试剂盒。

技术介绍

[0002]艾滋病病毒(HIV
‑
1)属于逆转录病毒，在复制过程中依赖缺乏校正功能的逆转录酶(Reverse transcriptase，RT)，因此常发生基因突变，使得HIV
‑
1基因具有多样性。目前HIV
‑
1基因型被分为四组：M(main)、O(outlier)、N(non
‑
M
‑
non
‑
O)和P组。目前HIV
‑
1M组在全球广泛流行，该组可进一步被分为10种亚型(A
‑
D、F
‑
H、J、K、L)和截止目前报道的132种循环重组形式(circulating recombinant form，CRF)以及几十种独特重组形式(unique recombinant form，URF)，不断出现的新型毒株给对HIV
‑
1分子监测、诊断和治疗提出了重大挑战。
[0003]HIV
‑
1基因组全长为9.7kb，但目前HIV
‑
1测序方法大多局限于部分基因序列(如gag、env、pol区)，片段化的测序方法可能会模糊亚型的鉴定结果，限制了流行病学特征的分析和重组断点的识别。获得HIV
‑
1全长基因组序列是进行HIV
‑
1分子病毒学研究的重要基础，对于研究病毒在特定人群或地区内的进化、传播和分布情况，确定新的亚型或流行重组型以及研发诊断试剂和疫苗等应用具有重要作用。此外，系统发育树的准确性与所用序列长度成显著比例，采用全长序列来构建系统发育树将有助于更准确地分析HIV
‑
1传播关系。
[0004]目前，近全长基因组(near full
‑
length genome，又被简称为NFLG)的序列特征是完整定义HIV
‑
1病毒的重要依据。HIV
‑
1近全长基因组测序技术依赖于有效的长链PCR扩增方法，通过扩增来增加病毒基因含量，使其达到测序所需量。由于较长的DNA模板变性困难、Taq酶在长片段PCR反应过程中活性下降等原因导致长片段PCR扩增方法成功率较低，并且HIV
‑
1基因组变异较大，通常导致HIV
‑
1近全长基因组扩增十分困难。
[0005]目前HIV
‑
1近全长基因组主要包括以下几种：
①
单扩增子策略：使用针对5
’
非编码区和3
’
非编码区的一对引物在单个PCR反应中扩增HIV
‑
1近全长基因组序列，但该方法扩增难度较大，扩增成功率较低。
②
双扩增子策略：针对两个重叠的半基因组序列进行扩增，第一个序列通常由gag基因和部分pol基因组成，第二个序列通常包括env和nef基因，通过两个半基因组的重叠部分，常为辅助基因(vif、vpr、vpu)，拼接得到近全长基因组序列。双扩增子策略相对于单扩增子策略的扩增成功率提高。
③
多扩增子策略：从多个PCR反应中选择三到五个重叠扩增子以覆盖近全长基因组。虽然多片段扩增PCR的成功率有所提高，但也存在后期拼接难度增大、反应成本增加等问题。
[0006]现有扩增引物为根据国外流行毒株基因组进行设计，由于国内外HIV
‑
1流行毒株的序列差异，采用现有扩增引物扩增国内流行亚型毒株序列的成功率较低，并且现有HIV
‑
1近全长基因组扩增方法的灵敏度较低。因此，本领域需要一种针对国内亚型通用的HIV
‑
1近全长基因组扩增引物组以及一种高灵敏和高成功率的相关扩增及测序方法。

技术实现思路

[0007]为了解决现有扩增方法所存在的缺陷，本专利技术人经过反复研究，通过对中国地区HIV
‑
1基因序列进行分析，提供了一组针对国内亚型通用的HIV
‑
1近全长基因组扩增引物组序列，并通过优化扩增反应体系和条件，提供了一种高灵敏度、高成功率的HIV
‑
1近全长基因组扩增及测序方法。由此，得到本专利技术。
[0008]因此，在第一方面，提供了一个用于扩增HIV
‑
1基因组的引物组，其包括：
[0009]gag
‑
pol片段一轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；
[0010]gag
‑
pol片段一轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；
[0011]gag
‑
pol片段二轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；
[0012]gag
‑
pol片段二轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；
[0013]pol
‑
nef片段一轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；
[0014]pol
‑
nef片段一轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；
[0015]pol
‑
nef片段二轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示；以及
[0016]pol
‑
nef片段二轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.8所示。
[0017]在第二方面，提供了一种用于扩增HIV
‑
1基因组的方法，包括使用第一方面所述的引物组对HIV
‑
1基因组进行两段式扩增。
[0018]在第三方面，提供了一种用于对HIV
‑
1基因组测序的方法，包括：
[0019]1)实施第二方面所述的方法，以获得gag
‑
pol片段和pol
‑
nef片段；
[0020]2)对所获得的gag
‑
pol片段和pol
‑
nef片段进行测序，以获得HIV
‑
1基因组序列。
[0021]在第四方面，提供了一种用于扩增HIV
‑
1基因组的试剂盒，包括：
[0022]a)第一方面所述的引物组；以及
[0023]b)用于指示如何使用该试剂盒的使用说明书。
[0024]在第五方面，提供了第一方面所述的引物组在制备用于扩增或测序HIV
‑
1的试剂盒中的用途。
[0025]本专利技术的有益效果在于：
[0026]本专利技术提供了一组针对国内亚型通用的HIV
‑
1近全长基因组扩增引物组序列SEQ ID NO.1
‑
SEQ ID NO本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一个用于扩增HIV
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1基因组的引物组，其包括：gag
‑
pol片段一轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.1所示；gag
‑
pol片段一轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.2所示；gag
‑
pol片段二轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.3所示；gag
‑
pol片段二轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.4所示；pol
‑
nef片段一轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.5所示；pol
‑
nef片段一轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.6所示；pol
‑
nef片段二轮正向引物，其序列如SEQ ID NO.7所示；以及pol
‑
nef片段二轮反向引物，其序列如SEQ ID NO.8所示。2.一种用于扩增HIV
‑
1基因组的方法，包括使用权利要求1所述的引物组对HIV
‑
1基因组进行两段式PCR扩增。3.根据权利要求2所述的方法，其包括以下步骤：a.提供HIV
‑
1RNA；b.将所述HIV
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1RNA逆转录为cDNA；c.以该cDNA为模板，使用权利要求1所述的引物组对HIV
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1基因组进行两段式PCR扩增，例如巢式PCR扩增，以获得gag
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pol片段和pol
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nef片段，优选采用PrimeSTAR GXL DNA polymerase扩增试剂来进行PCR扩增。4.一种用于对HIV
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【专利技术属性】
技术研发人员：金聪，张瑞凤，张鑫，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：