鲤科鱼类病原体多联检测引物组合、微流控芯片和试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种鲤科鱼类病原体多联检测引物组合、微流控芯片和试剂盒，属于生物技术领域。该核酸扩增引物组包括锦鲤疱疹病毒(KHV)LAMP引物组、鲤鱼浮肿病毒(CEV)LAMP引物组、鲤春病毒血症病毒(SVCV)LAMP引物组、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV

【技术实现步骤摘要】
鲤科鱼类病原体多联检测引物组合、微流控芯片和试剂盒


[0001]本专利技术涉及一种引物组合、微流控芯片、试剂盒及多联检测方法，尤其涉及一种鲤科鱼类病原体多联检测引物组合、微流控芯片、试剂盒及多联检测方法，属于生物


技术介绍

[0002]鲤科鱼类是我国重要的水产养殖品种，包括鲤，鲫等；根据2021年《中国渔业统计年鉴》，我国鲤，鲫养殖总产量超过500万吨，产业规模达数百亿元。随着养殖规模的扩大，集约化程度的提高，池塘水质环境恶化等诸多因素，鲤/鲫病毒性病害频发高发，对产业造成巨大经济损失的同时，也危及水产品质量安全。其中鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV
‑
2)、鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)、鲤鱼浮肿病毒(Carp edema Virus,CEV)、锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)等感染引起的鲤科鱼类病害呈现高流行性，高致病性等特征，严重影响我国鲤科鱼类养殖产业的健康可持续发展。然而，针对以上病毒性疫病尚无行之有效的治疗方法或防控药物；减少该类病原的流行性传播仍然是最有效的防控措施，这主要依赖于精准、快速、高通量的诊断技术。
[0003]环介导等温扩增技术(LAMP)广泛应用于病原检测诊断，其针对病原靶基因多区域设计4
‑
6种特异引物，在DNA聚合酶(链置换DNA聚合酶，Bst DNA polymerase)的作用下，生成自我循环扩增的颈环结构，使得靶标基因在短时间内大量、高效扩增；该技术除了高灵敏度、高特异性、反应时间短等优点外，不需要像PCR那样进行凝胶电泳或复杂高端的仪器设备，可基本满足基层快速诊断的需求。然而，水产疫病检测过程中不得不兼顾成本低，高通量，操作简单的客观需求；这也制约了该技术在水产疫病检测方面的应用。目前微流控芯片技术研究高速发展；该技术运用了微电机技术、微流体系统、生物化学等多方面技术在微纳米级别的空间内精确操控微尺度流体；多应用于物质分离，多生化指标检测等。微流控芯片技术是可把样品制备、核酸富集、纯化和检测等多个操作步骤集成到一块“微型化”的芯片上，简化操作过程(自动化处理)，可实现“样品进，结果出”。等温扩增技术是一种在恒温体系内对靶标核酸进行高效扩增的分子技术，其能够在短时间内完成目的基因的高指数增长。将核酸等温扩增技术与微流控芯片技术整合集成，能够凸显两者的优势，其不仅可以实现靶标核酸的快速扩增(保留环介导等温扩增技术的优势)，还可以降低反应体系，减少实验试剂耗材使用，增加检测通量，提高自动化水平等；两者整合集成在降低病原检测成本的同时凸显快速且高通量的优势；在水产病原快速检测、疫病精准诊断领域具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：本专利技术的目的是提供一种高通量、特异性好、灵敏度高的鲤科鱼类病原体多联检测引物组合；本专利技术的另一目的是提供一种鲤科鱼类病原体多联检测的微流控芯片；本专利技术的另一目的是提供一种鲤科鱼类病原体多联检测试剂盒；本专利技术的另一目的是
提供一种鲤科鱼类病原体多联检测方法。
[0005]技术方案：本专利技术的鲤科鱼类病原体多联检测引物组合，所述引物组合包括锦鲤疱疹病毒引物组、鲤鱼浮肿病毒引物组、鲤春病毒血症病毒引物组、鲤疱疹病毒Ⅱ型引物组，其中：
[0006]锦鲤疱疹病毒引物组包括SEQ：ID NO：1所示的上游外引物KHV
‑1‑
F3、SEQ ID NO：2所示的下游外引物KHV
‑1‑
B3、SEQ ID NO：3所示的上游内引物KHV
‑1‑
FIP、SEQ ID NO：4所示的下游内引物KHV
‑1‑
BIP、SEQ ID NO：5所示的上游环引物KHV
‑1‑
FLP、SEQ ID NO：6所示的下游环引物KHV
‑1‑
BLP；
[0007]鲤鱼浮肿病毒引物组包括SEQ：ID NO：7所示的上游外引物CEV
‑1‑
F3、SEQ ID NO：8所示的下游外引物CEV
‑1‑
B3、SEQ ID NO：9所示的上游内引物CEV
‑1‑
FIP、SEQ ID NO：10所示的下游内引物CEV
‑1‑
BIP、SEQ ID NO：11所示的上游环引物CEV
‑1‑
FLP、SEQ ID NO：12所示的下游环引物CEV
‑1‑
BLP；
[0008]鲤春病毒血症病毒引物组包括SEQ：ID NO：13所示的上游外引物SVCV
‑1‑
F3、SEQ ID NO：14所示的下游外引物SVCV
‑1‑
B3、SEQ ID NO：15所示的上游内引物SVCV
‑1‑
FIP、SEQ ID NO：16所示的下游内引物SVCV
‑1‑
BIP、SEQ ID NO：17所示的上游环引物SVCV
‑1‑
FLP、SEQ ID NO：18所示的下游环引物SVCV
‑1‑
BLP；
[0009]鲤疱疹病毒Ⅱ型引物组包括SEQ：ID NO：19所示的上游外引物CyHV
‑2‑1‑
F3、SEQ ID NO：20所示的下游外引物CyHV
‑2‑1‑
B3、SEQ ID NO：21所示的上游内引物CyHV
‑2‑1‑
FIP、SEQ ID NO：22所示的下游内引物CyHV
‑2‑1‑
BIP、SEQ ID NO：23所示的上游环引物CyHV
‑2‑1‑
FLP、SEQ ID NO：24所示的下游环引物CyHV
‑2‑1‑
BLP。
[0010]另一方面，本专利技术提供一种鲤科鱼类病原体多联检测的微流控芯片，所述微流控芯片上包埋有上述的引物组的干粉。
[0011]作为上述方案的进一步改进，所述微流控芯片包括若干个电极单元，每一个电极单元内包埋一种病原体的引物组。
[0012]作为上述方案的进一步改进，所述电极单元包括主输液电极通道、储液电极以及检测电极。
[0013]包埋构建鲤科鱼类病原微流控检测芯片，所述微流控芯片包含所述锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤鱼浮肿病毒(CEV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV
‑
2)四种病原微生物的LAMP引物组。所述微流控芯片，包埋有锦鲤疱疹病毒(KHV)、鲤鱼浮肿病毒(CEV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、鲤疱疹病毒Ⅱ型(CyHV
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2)四种病原微生物的引物干粉。优化微流控芯片包埋所述四组引物组的浓度比例：优选地，锦鲤疱疹病毒引物组干粉中，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1～2：4～8：2～4，更优选地，外引物、内引物和环引物的摩尔比为1：4：2；优选地，锦鲤疱疹病毒引物组干粉中，外引物、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.鲤科鱼类病原体多联检测引物组合，其特征在于，所述引物组合包括锦鲤疱疹病毒引物组、鲤鱼浮肿病毒引物组、鲤春病毒血症病毒引物组、鲤疱疹病毒Ⅱ型引物组；其中：锦鲤疱疹病毒引物组包括SEQ：ID NO：1所示的上游外引物KHV
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F3、SEQ ID NO：2所示的下游外引物KHV
‑1‑
B3、SEQ ID NO：3所示的上游内引物KHV
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FIP、SEQ ID NO：4所示的下游内引物KHV
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BIP、SEQ ID NO：5所示的上游环引物KHV
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FLP、SEQ ID NO：6所示的下游环引物KHV
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BLP；鲤鱼浮肿病毒引物组包括SEQ：ID NO：7所示的上游外引物CEV
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F3、SEQ ID NO：8所示的下游外引物CEV
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B3、SEQ ID NO：9所示的上游内引物CEV
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FIP、SEQ ID NO：10所示的下游内引物CEV
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BIP、SEQ ID NO：11所示的上游环引物CEV
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FLP、SEQ ID NO：12所示的下游环引物CEV
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BLP；鲤春病毒血症病毒引物组包括SEQ：ID NO：13所示的上游外引物SVCV
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F3、SEQ ID NO：14所示的下游外引物SVCV
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B3、SEQ ID NO：15所示的上游内引物SVCV
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FIP、SEQ ID NO：16所示的下游内引物SVCV
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BIP、SEQ ID NO：17所示的上游环引物SVCV
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FLP、SEQ ID NO：18所示的下游环引物SVCV
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BLP；鲤疱疹病毒Ⅱ型引物组包括SEQ：ID NO：19所示的上游外引物CyHV
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F3、SEQ ID NO：20所示的下游外引物CyHV
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B3、SEQ ID NO：21所示的上游内引物CyHV<...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻飞，赵哲，郝凯，史燕，钱津，金兴坤，潘明轩，
申请(专利权)人：江苏省沿海投资开发有限公司，
类型：发明
国别省市：