基于数字PCR检测鼻咽癌中EB病毒的引物探针组合制造技术

一种用于检测EB病毒的引物组合及其试剂盒，所述引物组合用于检测第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种，所述第一目标序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列所构成的组。发明专利技术提供的引物可以明显提高临床检测EB病毒的灵敏度，特别是针对早期样本的检测具有较高准确性。准确性。准确性。

【技术实现步骤摘要】
基于数字PCR检测鼻咽癌中EB病毒的引物探针组合


[0001]本专利技术涉及医学检测
，具体涉及一种用于检测EB病毒的引物组合及其试剂盒。

技术介绍

[0002]鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma,NPC)是来源于鼻咽粘膜上皮的恶性肿瘤，主要流行于中国南部、东南亚及非洲北部等地区。鼻咽癌发病分布具有独特的地域特点，其高发于我国南方地区，尤其是在两广的分布呈现典型的聚集的现象，具有代表性的有广东的中山地区和广西的苍梧县，发病率高达50/100000。鼻咽癌男性发病率约为女性的2
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3倍，在中国南方男性中的发病率高达30.9/10万人。鼻咽癌的发生一般认为主要与遗传因素、环境因素和EB病毒(Epstein
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Barr virus,EBV)感染等密切相关。现已证实EBV感染是鼻咽癌发生的重要原因之一。
[0003]EB病毒(Epstein
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Barr virus,EBV)是Epstein和Barr在1964年首先从非洲儿童淋巴瘤(Burkitt淋巴瘤)的活检组织中发现的一种DNA病毒颗粒，属于γ病毒亚科，EBV基因组长约172Kb,编码约85个基因，EBV具有疱疹病毒潜伏感染的特点，在潜伏期和裂解期表达不同的病毒基因和蛋白。EBV潜伏期表达的基因主要包括6个核抗原(EBV nuclear antigens，EBNAs)，即EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3B、EBNA3C和BNA
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LP，2个EBV编码小RNA(EBV
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encoded small RNAs，EBERs)，即EBER1和EBER2，3个潜伏膜蛋白(latent membrane proteins，LMPs)，即LMP1、LMP2A和LMP2B，BamHI
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A向右开放读码框的转录产物(BamHI
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A rightward transcripts，BARTs)以及微小RNAs(micro RNAs，包括miR
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BHRF1和miR
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BART)。在裂解性感染时，大量的病毒结构基因和调节基因表达，包括即刻早期基因、早期基因和晚期基因。
[0004]EB病毒在世界范围内广泛存在，90％的成年人携带EBV。EBV感染多为无症状感染，但部分人群可发生良性或恶性疾病。EB病毒除了可引发鼻咽癌之外，还与多种肿瘤的发生有关，如Burkitt淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、NK/T细胞淋巴瘤、胃癌、移植后淋巴增生性疾病等，总的来说，EBV与1.5％的人类癌症有关。鼻咽癌是所有EBV相关肿瘤中与EBV关系最为密切的肿瘤，病毒学检测显示所有鼻咽癌细胞中均可检测到EBV DNA和EBV编码物质。
[0005]当前，鼻咽癌的诊断以鼻腔镜的检测为主，但由于操作烦琐、价格昂贵，不便于鼻咽癌检测的普及。以放射治疗为主的综合治疗是治疗鼻咽癌的主要方式，随着该疗法的广泛应用，鼻咽癌患者的5年生存率达80％以上，因此临床上鼻咽癌的早诊早治成为提高患者生存率、改善预后的关键突破口。
[0006]血浆EBV DNA检测是继EBV抗体检测之后最后关注的指标，已经获得了广泛的认可。在鼻咽癌治疗中检测血浆EB DNA的原理是由于鼻咽癌肿瘤细胞在凋亡的过程中会释放EB V DNA。这些由NPC释放的EBV DNA片段与病毒裂解阶段释放片段相比具有更短小的特点(少于181bp)，这使得它们可以通过聚合酶链式反应(PCR)的方法进行分析和定量。
[0007]血浆中EBV DNA检测不但在鼻咽癌的诊断和筛查中表现出较高的应用价值，事实上，目前已经应用于鼻咽癌管理的整个流程，包括与TNM分期做为参考进行治疗方的制定，
治疗过程的监测，治疗之后预测预后，治疗后是否辅助化疗方案的制定等。
[0008]实时荧光定量PCR方法是目前血浆EBV DNA检测应用最普遍的方法。常规临床应用中使用实时荧光定量PCR方法检测血浆EBV DNA会受到检测阈值的限制，导致即使同一样本在不同实验室中，检测的EBV DNA水平存在显著的实验室间差异。且对于低拷贝靶标的样本，荧光定量PCR检测方法的灵敏度和精确度不足，不利于进行鼻咽癌早期筛查以及治疗后的监测和预后。因此有必要研制出灵敏度更高、更精确的血浆EBV DNA定量监测试剂盒，以提高EBV DNA检测临床应用的可靠性。
[0009]数字PCR是近年来出现的较为先进的方法，液滴芯片式数字PCR平台采用绝对定量的方式，不依赖标准曲线和定量参考品，直接检测目标序列的拷贝数，它的原理是将一个标准PCR反应通过芯片分配到大量微小的油包水液滴当中，每个液滴种包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增，”在芯片中进行PCR扩增后，通过拍照对液滴方式来检测液滴的荧光强度，最后通过阳性液滴的比例计算出目标核酸分子的绝对拷贝数。因此，使用该方法进行EBV DNA检测和定量，有望提高检测的灵敏度和准确度。
[0010]目前临床上检测EBV
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DNA主要是结合实时荧光定量PCR技术和TaqMan技术，根据EB病毒基因组保守区域设计特异引物及TaqMan探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，在PCR延伸过程中，Taq酶的外切酶活性将探针5
′
段荧光基团切下来，使之游离在体系中，脱离3
′
段淬灭基团的淬灭作用而发出荧光，可供相应荧光仪器检测，从而实现对EB病毒核酸的检测。在实时荧光定量PCR技术中，引物探针组合是决定检测灵敏度和特异性的关键因素。
[0011]目前国内外已有多款基于实时荧光定量PCR技术检测EB病毒的试剂盒，但是这些试剂盒检测灵敏度相对偏低，不利于临床应用中该病毒引发的疾病中的肿瘤早筛和预后治疗。因此提高EB病毒检测的灵敏度，在EB病毒感染疾病的诊断及临床应用中尤为重要。

技术实现思路

[0012]根据第一方面，在一实施例中，提供一种引物组合，所述引物组合用于检测EB病毒，所述引物组合用于检测第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种，所述第一目标序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列所构成的组。
[0013]根据第二方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包括第一方面任意一项所述的引物组合。
[0014]根据第三方面，在一实施例中，提供第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种在制备检测试剂中的用途；所述第一目标序列包含SEQ ID NO:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列所构成的组。
[0015]在一实施例中，本专利技术提供的引物可以明显本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合，其特征在于，所述引物组合用于检测EB病毒，所述引物组合用于检测第一目标序列、第二目标序列、第三目标序列中的至少一种，所述第一目标序列包含SEQID NO:1所示核苷酸序列所构成的组，所述第二目标序列包含SEQ ID NO:5所示核苷酸序列所构成的组，所述第三目标序列包含SEQ ID NO:9所示核苷酸序列所构成的组。2.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合中的至少一种；所述第一引物组合包含SEQ ID NO:2～3所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种；所述第二引物组合包含SEQ ID NO:6～7所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种；所述第三引物组合包含SEQ ID NO:10～11所示核苷酸序列所构成的组中的至少一种。3.如权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物组合包含第一引物组合、第二引物组合、第三引物组合中的至少两种。4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：任浩凡，温碧霞，卢丹，吴天准，
申请(专利权)人：深圳市中科先见医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：