用于定性检测艾滋病病毒的试剂和方法技术

本发明专利技术提供一组用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的引物对，包含该引物对以用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的试剂盒，以及使用该引物对或试剂盒通过多重荧光PCR扩增反应对艾滋病病毒进行检测的方法。通过本发明专利技术，可以实现低至10cps的检测下限，并且相对于现有检测方法更为准确。

【技术实现步骤摘要】
用于定性检测艾滋病病毒的试剂和方法
本专利技术涉及人类艾滋病病毒检测领域，具体地，本专利技术涉及一组用于多重荧光PCR扩增反应的引物对、包括该引物对的试剂盒、以及使用该试剂盒对艾滋病病毒进行检测的方法。
技术介绍
人类免疫缺陷病毒(HumanImmunodeficiencyVirus,HIV)，又称艾滋病病毒，是一种双链RNA逆转录病毒，进入人体后选择性入侵人体免疫系统的CD4+T淋巴细胞和巨噬细胞，在细胞内经逆转录机制合成cDNA，形成整合前复合体并整合进入宿主细胞的基因组DNA中，这称为DNA前病毒(proviralDNA)。根据HIV病毒的生活史，HIV-1RNA与DNA前病毒是同一种物质的两种存在形式。但DNA前病毒因为整合到人体基因组而比RNA更稳定，因为DNA前病毒和HIV-1RNA基因碱基序列相同，在PCR反应中可以同时检测到。在医学研究中，游离在血浆中的HIV病毒通常称为HIV-RNA，而来自外周血免疫细胞的HIV病毒称为DNA前病毒。HIV基因组长约9.2～9.7kb，含GAG、POL、Env三个结构基因，及至少六个调控基因。HIV实验室检测技术对AIDS的诊断、治疗及疫情监测极其重要。目前检测HIV的方法有多种，总体来说分为免疫学检测和病毒学检测。免疫学检测是通过检测HIV的抗体间接地诊断HIV感染，按原理分包括酶联免疫法、化学发光法和快速法等。作为诊断艾滋病的一个主要手段，免疫学检测目前已经普遍用于临床、急诊、血液筛查等各个领域。但是抗体通常是在感染后3～8周才能够被检测出来，因此免疫学方法是一种间接且滞后的检测方法，原因是检测的目标是人体内产生的抗体而不是病原体本身。艾滋病的病毒学检测与免疫学检测方法相比，具有特异性强和灵敏度高的特点，因此有助于实现缩短检测窗口期而进行早期诊断，避免漏检，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向。更为重要的是，HIV阳性孕妇所生婴儿由于其体内带有母体的IGG抗体，这种抗体最长可持续到18个月，在这一时间内检测抗体不能确定婴儿感染状况，只能用病毒学检测方法。目前，针对HIV基因检测的试剂盒多为检测血浆中HIV-1RNA的产品，例如，罗氏公司“人类免疫缺陷病毒(1型)核酸检测试剂盒(AmpliPrep/HIV-1QualitativeTest，version2.0)检测试剂盒”为HIV核酸定性检测，但它检测的靶物质仍然是HIV-1RNA，其检测的毒株主要以欧美流行的B亚型为主，在检测过程中要把RNA逆转录生成互补DNA(cDNA)，并且会扩增之后在CT值较大(大于等于33)时出现假阳性的问题。又例如，现有技术CN106119413A的使用长末端重复序列(longterminalrepeats，LTR)序列和GAG结构蛋白基因作为引物，在检测期间两区同时扩增，该方法具有改进的敏感性与特异性，但仍具有出现假阳性的问题。因此，需要一种对艾滋病病毒核酸的定性检测具有提高的检测敏感性与特异性的检测技术，其不仅能够解决目前现有试剂盒会出现的假阳性问题，而且能够适于HIV阳性产妇所生暴露婴儿感染早期诊断、HIV抗体不确定者的鉴别诊断及正处于HIV抗体窗口期的检测、抗体检测的补充试验、以及检验检疫和疫情防控等多个领域。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有更高灵敏度和特异性的用于检测艾滋病病毒的方案。本专利技术在对大量参考序列进行分析比对后，选择HIV-1的长末端重复序列LTR、GAG和POL结构基因为靶基因，通过多重荧光PCR来对其进行扩增，从而实现了针对艾滋病病毒的核酸定性检测，由此完成了本专利技术。因此，在第一方面，本专利技术提供了一组用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的引物对，其中所述引物对包括：LTR上游引物：5'-AAGGCTACTTCCCTGATT-3'(SEQIDNO:1)；LTR下游引物：5'-TTGGCTTCTTCTAACTTCTC-3'(SEQIDNO:2)；GAG上游引物：5'-CAGAATGGGATAGAGTGC-3'(SEQIDNO:4)；GAG下游引物：5'-TACTGGGATAGGTGGATT-3'(SEQIDNO:5)；POL上游引物：5'-TAAGACAGCAGTACAAATGGCAG-3'(SEQIDNO:7)；POL下游引物：5'-GCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3'(SEQIDNO:8)。在第二方面，本专利技术提供了一个用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括第一方面的引物对。在第三方面，本专利技术提供了一种用于通过多重荧光PCR扩增反应对艾滋病病毒进行检测的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：(1)提取待测样品DNA；(2)以待测样品DNA为模板，使用第一方面的引物对、或者第二方面的试剂盒来进行多重荧光PCR扩增反应；(3)对所述多重荧光PCR扩增反应结果进行判断：若被扩增的三个基因中有两个或者三个基因的Ct值﹤35并且扩增曲线呈S型，则判断存在艾滋病病毒，若被扩增的三个基因中没有一个呈现扩增曲线或者存在Ct值，则判断不存在艾滋病病毒，若被扩增的三个基因中仅有一个的Ct值﹤35并且扩增曲线呈S型，则判断不确定是否存在艾滋病病毒。在第四方面，本专利技术提供了第一方面的引物对在制备用于检测艾滋病病毒核酸的检测剂中的用途。本专利技术的有益之处在于：本专利技术有极高的灵敏度，即便样品中仅存在低至10cps的艾滋病病毒，也能对其进行正确检测；采用本专利技术进行检测，所需时间短，仅3小时即可获得检测结果；本专利技术具有广谱特异性，能对HIV-1的多种亚型进行有效而正确的检测；本专利技术有着极高的检测准确性，并且对于样品的类型没有选择性，即便是对于干血斑样品检测结果也同样准确。附图说明得益于以下具体实施方式以及参考附图，本专利技术的技术方案和益处对本领域技术人员会变得显而易见。图1为本专利技术的一个具体实施方案的多重荧光PCR检测LTR基因的灵敏度结果(FAM)。图2为本专利技术的一个具体实施方案的多重荧光PCR检测GAG基因的灵敏度结果(HEX)。图3为本专利技术的一个具体实施方案的多重荧光PCR检测POL基因的灵敏度结果(CY5)。图4为本专利技术的一个具体实施方案的多重荧光PCR检测HIV阳性感染者的典型结果。图5为本专利技术的一个具体实施方案的多重荧光PCR检测HIV阴性感染者的典型结果。具体实施方式下面对本专利技术进行详细的描述。需理解，以下描述仅以示例方式来对本专利技术进行说明，而无意于对本专利技术的范围进行限制，本专利技术的保护范围以随附权利要求为准。并且，本领域技术人员理解，在不背离本专利技术的精神和主旨的情况下，可以对本专利技术的技术方案进行修改。若并未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。如上所述，本领域需要一种对艾滋病病毒核酸的定性检测具有提高的检测敏感性与特异性的检测技术。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一组用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的引物对，其中所述引物对包括：/nLTR上游引物：5'-AAGGCTACTTCCCTGATT-3'(SEQ ID NO:1)；/nLTR下游引物：5'-TTGGCTTCTTCTAACTTCTC-3'(SEQ ID NO:2)；/nGAG上游引物：5'-CAGAATGGGATAGAGTGC-3'(SEQ ID NO:4)；/nGAG下游引物：5'-TACTGGGATAGGTGGATT-3'(SEQ ID NO:5)；/nPOL上游引物：5'-TAAGACAGCAGTACAAATGGCAG-3'(SEQ ID NO:7)；/nPOL下游引物：5'-GCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3'(SEQ ID NO:8)。/n

【技术特征摘要】
1.一组用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的引物对，其中所述引物对包括：
LTR上游引物：5'-AAGGCTACTTCCCTGATT-3'(SEQIDNO:1)；
LTR下游引物：5'-TTGGCTTCTTCTAACTTCTC-3'(SEQIDNO:2)；
GAG上游引物：5'-CAGAATGGGATAGAGTGC-3'(SEQIDNO:4)；
GAG下游引物：5'-TACTGGGATAGGTGGATT-3'(SEQIDNO:5)；
POL上游引物：5'-TAAGACAGCAGTACAAATGGCAG-3'(SEQIDNO:7)；
POL下游引物：5'-GCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3'(SEQIDNO:8)。


2.根据权利要求1所述的引物对，其中所述引物对还包括针对β-肌动蛋白(ACTB)的引物对：
ACTB上游引物：5'-ATTTGGACCTGCGAGCG-3'(SEQIDNO:10)；
ACTB下游引物：5'-AGCGGCTGTCTCCACAAGT-3'(SEQIDNO:11)。


3.一个用于通过多重荧光PCR扩增反应检测艾滋病病毒的试剂盒，其中所述试剂盒包括：权利要求1或2所述的引物对。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其中所述试剂盒还包括以下荧光探针：
LTR荧光探针：5'-FAM-CAAGCTAGTACCAGTT-ECLIPSE-3'(SEQIDNO:3)；
GAG荧光探针：5'-HEX-GAGTGCATCCAGTGCAT-ECLIPSE-3'(SEQIDNO:6)；
POL荧光探针：5'-CY5-ATTACAGGGACAGCAGAA-ECLIPSE-3'(SEQIDNO:9)；以及
任选的ACTB荧光探针：5'-TEXASRED-CTGACCTGAAGGCTCTGC-ECLIPSE-3'(SEQIDNO:12)。


5.一种用于通过多重荧光PCR扩增反应对艾滋病病毒进行检测的方法，所述方法用于非诊断目的，包括以下步骤：
(1)提取待测样品DNA；
(2)以待测样品DNA为模板，使用权利要求1所述的引物对、或者权利要求3所述的试剂盒来进行多重荧光PCR扩增反应；
(3)对所述多重荧光PCR扩增反应结果进行判断：
若被扩增的三个基因中有两个或者三个基因的Ct值﹤35并且扩增曲线呈S型，则判断存在艾滋病病毒，
若被扩增的三个基因中没有一个呈现扩增曲线或者存在Ct值，则判断不存在艾滋病病毒，
若被扩增的三个基因中仅有一个的Ct值﹤35并且扩增曲线呈S型，则判断不确定是否存在艾滋病病毒。


6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述多重荧光PCR扩增反应的条件为：
-预变性温度：94℃，预变性时间：5分...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚均，蒋岩，王爱玲，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心，中国疾病预防控制中心妇幼保健中心，
类型：发明
国别省市：北京;11