用于加A法miRNA合成第一链cDNA的方法及产品技术

本发明专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于加A法miRNA合成第一链cDNA的方法及产品。具体技术方案为：一种用于加A法miRNA合成第一链cDNA的逆转录引物，所述引物的序列从5

【技术实现步骤摘要】
用于加A法miRNA合成第一链cDNA的方法及产品


[0001]本专利技术属于分子生物学领域，具体涉及一种用于加A法miRNA合成第一链cDNA的方法及产品。

技术介绍

[0002]microRNA(以下简称miRNA)是一类被广泛关注的非编码小RNA，长度为22nt左右，其对植物和动物的基因表达有着非常重要的调控作用。由于miRNA长度极短，而常规的实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(Quantitative Real
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time PCR，以下简称qPCR)的扩增片段往往在50～200bp之间，因此很难对miRNA的表达量进行鉴定。
[0003]现有技术中，对miRNA的定量研究主要包括茎环法和加A尾法逆转录
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qPCR系统(以下简称加A法)。茎环法miRNA的定量研究方法最早来自ABI公司采用的特殊结构的茎环反转录引物探针法，目前已发展为常规茎环
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SYBR染料法。这类方法具有特异性高、定量准确的优点，但当检测多个miRNA样本时，需要对每个样本都进行反转录，并分别设计多对成套的引物，操作繁琐且成本高。而加A法的miRNA定量研究的雏形是2008年Soroush首次报道的miR
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Q技术，该技术在2011年被Ingrid Balcells等人进行了改良。加A法的原理是对miRNA进行加A后，采用含tag和Oligo dT的引物进行反转录，使原本很短的miRNA序列反转录产生的cDNA序列延长，之后采用含特异性序列的上下游引物进行qPCR。该方法的优势在于，同一个RNA反转录产物可以用于多个miRNA样本的表达量检测，且可很好地区分单个碱基差异的miRNA。
[0004]但现有的加A法依然存在检测灵敏度低、产品特异性差、加A及逆转录效率不高、需要搭配特定qPCR产品使用等缺陷，限制其进一步推广应用。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种一种检测灵敏度更高、加A和逆转录效率更高、后续无需搭配特定qPCR产品使用的用于加A法miRNA合成第一链cDNA的方法及产品。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种用于加A法miRNA合成第一链cDNA的逆转录引物，所述引物的序列从5
’
端到3
’
端依次为：5～15个碱基的通用引物序列、10～20个Oligo(dT)、1～3个与miRNA 3
’
配对的锚定碱基。
[0007]优选的，所述逆转录引物序列为：CAAAGGACCTTTTTTTTTTTTTTTVN。
[0008]相应的，含有所述逆转录引物的用于加A法miRNA合成第一链cDNA的体系。
[0009]优选的，所述体系包括逆转录酶混合试剂，所述逆转录酶混合试剂包括Poly(A)聚合酶、逆转录酶和RNase抑制剂。
[0010]优选的，所述逆转录酶混合试剂按浓度比包括：Poly(A)聚合酶:逆转录酶:RNase抑制剂＝0.5～5:50～500:100～1000。
[0011]优选的，所述体系包括缓冲试剂，所述缓冲试剂中包括Mg
2+
、Na
+
、K
+
、dNTPs加A尾所需的ATP，其中，Na
+
和Cl
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浓度大于500mM。
[0012]优选的，所述缓冲试剂包括：1～20mM的MgCl2、80～200mM的KCl、0.4～2M的NaCl、0.05～1mM的dNTPs、1～5mM的ATP。
[0013]优选的，所述缓冲试剂还包括：50～100mM的Tris
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HCl、0.5～2mM的DTT、0.1％～1％，V/V的吐温20、0.05％～1％，w/w的BSA。
[0014]相应的，利用所述体系进行加A法合成cDNA的方法，将所述体系在37～42℃下反应30～60min，再在85～95℃下失活5s～1min。
[0015]相应的，利用所述体系进行加A法合成cDNA反应结束后，用于反应结果逆转录
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qPCR检测的通用反向引物，所述通用反向引物序列为：GGGCAAAGGACCTTTTTT。
[0016]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术提供了特定的逆转录酶混合试剂和缓冲试剂，可适用于多种miRNA模板，且检测灵敏度更高。本专利技术测试的单链miRNA投入量可低至60copies，总miRNA投入量可低至10pg。
[0017]同时，本专利技术的加A及逆转录效率更高，加A及逆转录过程仅需50min即可完成。
附图说明
[0018]图1为本专利技术体系反应原理示意图；
[0019]图2为使用本专利技术体系进行不同拷贝数的人工合成miR
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let7e
‑
5p模板加尾逆转录及qPCR测定结果示意图；
[0020]图3为使用本专利技术体系进行不同浓度的总miRNA模板加尾逆转录及qPCR测定结果示意图；
[0021]图4为加尾逆转录及qPCR测定的性能展示示意图；
[0022]图5不同加尾逆转录条件进行反应后的结果展示示意图；
[0023]图6为单碱基特异性测定效果示意图。
具体实施方式
[0024]本专利技术提供了一种用于加A法miRNA合成第一链cDNA的体系，具体包括适用于多种miRNA模板的逆转录酶混合试剂和缓冲试剂，并提供了逆转录引物。本专利技术体系反应原理具体如图1所示，在一个反应体系中，miRNA被Poly(A)加尾后进行逆转录。逆转录引物包含三个部分，序列从5
’
端到3
’
端依次为：5～15个碱基的通用引物序列、10～20个Oligo(dT)和1～3个与miRNA 3
’
配对的锚定碱基。qPCR过程是以miRNA的第一链cDNA为模板，用miRNA特异上游引物和下游通用引物进行扩增。
[0025]所述逆转录酶混合试剂可同时实现加A和逆转录合成第一链cDNA的作用，具体包括Poly(A)聚合酶、逆转录酶和RNase抑制剂。所述Poly(A)聚合酶能够在不依赖模板的情况下，将由ATP转化成的AMP催化添加到单链miRNA的3
’
末端，形成Poly(A)尾结构。所述逆转录酶具有极高的热稳定性和抗反应抑制剂的能力，不具有RNase H活性，能够在15～30分钟内合成第一链cDNA。所述RNase抑制剂能够广泛抑制各种类型的RNase，具有很高的抗氧化活性。优选的方案为，按浓度比(单位为U)，Poly(A)聚合酶:逆转录酶:RNase抑制剂＝0.5～5:50～500:100～1000。更优选的方案为，所述逆转录酶混合试剂包括：2.5U的Poly(A)聚合酶、100U的MMLV、80U的RNase抑制剂。
[0026]所述缓冲试剂为高盐缓冲试剂(Na
+
和Cl
‑
浓度大于500本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于加A法miRNA合成第一链cDNA的逆转录引物，其特征在于：所述引物的序列从5
’
端到3
’
端依次为：5～15个碱基的通用引物序列、10～20个Oligo(dT)、1～3个与miRNA 3
’
配对的锚定碱基。2.根据权利要求1所述逆转录引物，其特征在于：所述逆转录引物序列为：CAAAGGACCTTTTTTTTTTTTTTTVN。3.含有权利要求1或2所述逆转录引物的用于加A法miRNA合成第一链cDNA的体系。4.根据权利要求3所述体系，其特征在于：所述体系包括逆转录酶混合试剂，所述逆转录酶混合试剂包括Poly(A)聚合酶、逆转录酶和RNase抑制剂。5.根据权利要求4所述体系，其特征在于：所述逆转录酶混合试剂按浓度比包括：Poly(A)聚合酶:逆转录酶:RNase抑制剂＝0.5～5:50～500:100～1000。6.根据权利要求3所述体系，其特征在于：所述体系包括缓冲试剂，所述缓冲试剂中包括Mg
2+
、Na
+
...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，滕人达，孙晓亮，竹个个，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：