一种测定mRNA3制造技术

本发明专利技术公开一种测定mRNA 3

【技术实现步骤摘要】
一种测定mRNA 3
’
Poly(A)尾长度及其分布的方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地涉及一种测定mRNA 3
’
Poly(A)尾长度及其分布的方法。

技术介绍

[0002]作为一种治疗性或预防性的药物产品，mRNA药物必须依照法规要求进行深入的分析表征。国家药监局发布的《新型冠状病毒预防用mRNA疫苗药学研究技术指导原则》，提到对于mRNA体外合成需要进行过程和产物的控制检测，包括加帽率、加Poly(A)尾长度等。2022年2月23日美国药典(USP)制定新的“mRNA疫苗质量分析方法”指南草案，支持mRNA疫苗和疗法的质量评估。2022年5月31日国家药监局药审中心(CDE)也发布了“体外基因修饰系统药学研究与评价技术指导原则(试行)”用于强化mRNA药品的质量标准。
[0003]由于5
’
端帽子结构和3
’ꢀ
Poly(A)尾结构在mRNA的翻译及稳定性中起着重要的调节作用，因此测定mRNA的加帽效率及3
’ꢀ
Poly(A)尾长度和分布是评价mRNA质量的重要指标。
[0004]3’
端Poly(A)尾巴对于mRNA的翻译来说发挥着至关重要的作用，它可以保护mRNA不被降解，增加mRNA的稳定性，提高翻译效率。因此，有效地检测核酸尾部Poly A的长度及不同长度A的占比是评估mRNA质量的重要指标。
[0005]目前常用的Poly(A)尾检测方法有变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、毛细管电泳（CE）、液相色谱（HPLC）以及液相色谱质谱联用（LC
‑
MS）等。另外，基于二代或三代测序技术，也可以用于表征Poly(A)，已报道的测序方法包括TAIL
‑
seq、PAL
‑
seq、FLAM
‑
Seq、PAIso
‑
Seq和纳米孔RNA直接测序平台等，都能够较准确地给出Poly(A)尾巴长度信息。
[0006]对于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，利用工具酶酶切后并纯化回收3
’
端PolyA尾，随后进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对经过处理后PolyA尾的样品进行定性分析。该方法对于样本量没有太高要求，但是在实际应用中容易受到片段大小、凝胶分辨率等许多因素的影响，导致灵敏度不佳，通常用于早期定性研究。
[0007]HPLC方法是将不同样本流出物的组成和含量变化转变为电信号，通过电子仪器测定，从而实现定性定量，来表征mRNA的产品纯度和完整性。但其分辨率很难将含不同PolyA尾结构的mRNA区分开来，样本量要求很高并且针对不同序列需要重新建立方法，较为繁琐，因此通常不单一使用来对mRNA 3
’
端PolyA尾进行检测。不过HPLC无法对mRNA 3
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端PolyA尾（多数mRNA的PolyA长度为50
‑
200nt）分子量进行准确测定，且不同长度3
’
端PolyA尾相邻长度分子量差距329.2Da，呈现为正态分布或者类正态分布，难以实现有效分离。
[0008]对于基于测序平台的PolyA尾检测，基于Illumina平台的TAIL
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Seq和PAL
‑
Seq技术，以及第三代测序技术PacBio平台，通过构建cDNA文库对PolyA尾或全长mRNA进行测序，可检测PolyA尾长度和序列完整性。但二者均依赖于PCR扩增cDNA，长均聚物的存在导致PCR扩增不可避免地存在偏差，可能对PolyA尾长和序列准确性造成影响。Oxford NanoporeTechnologies（ONT）开发的纳米孔RNA直接测序技术分析PolyA尾方法，不依赖于
逆转录与PCR扩增，可以实现PolyA尾部长度及序列准确性的检测，不存在PCR偏倚性。然而以TAILseq、PALseq、FLAMseq、PATseq及纳米孔测序为代表的测序技术通量大、设备要求高，鉴于体外合成的mRNA通量较小，无法体现测序技术的高通量优势。
[0009]液相色谱质谱联用（LC
‑
MS）是根据混合物的物理化学性质，分离混合物中各种组分，并通过质谱进行检测，最后使用仪器配套的专业软件在高分辨率模式下分析图谱。目前常用的3
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Poly(A)尾长度检测方法利用RNase T1核酸酶作用于鸟嘌呤核苷酸（G）3
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端磷酸，切割相邻核苷酸之间的磷酸二酯键，特异性地切割单链RNA，释放Poly(A)序列。使用oligo
‑
dT磁珠对样品进行纯化，纯化后的样品进行液相色谱
‑
质谱联用仪（LC
‑
MS）检测，检测可分析其长度与组成。目前，Poly(A)尾的检测方法比较通用、分辨率较高的是液相色谱质谱联用（LC
‑
MS）方法。
[0010]由于LC
‑
MS可以提供的样品剂量非常精确，分析速度很快，因此它在复杂混合物分析以及痕量分析时可以发挥很大的作用。LC
‑
MS可以精准的进行定量，对不同长度3
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端PolyA尾相邻长度分子量差距329.2Da，进行精准测定，但其局限性也很明显，通常需要专人操作且价格十分昂贵，在对mRNA表征方面，比较适合前端进行高准确率的验证。
[0011]此外，该分析方法中所用的RNase T1是一种核糖核酸内切酶，可特异性降解在G残基处的单链RNA。其通过形成相应的中间体2
’
,3
’‑
环磷酸盐，切割相邻核苷酸的3
’‑
鸟苷残基和5
’‑
OH残基之间的磷酸二酯键。因此mRNA经RNase T1酶后的Poly(A)核苷酸片段，除了产生预期的含有Poly(A)核苷酸片段外，可能含有非A碱基（如C、U、G碱基）的核苷酸片段，不能得到纯的Poly(A)尾核苷酸片段。

技术实现思路

[0012]针对现有技术中存在的至少部分问题，尤其是基于RNase T1酶切割纯化，虽然用Oligo(dT)磁珠进行Poly(A)尾的富集得到3
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末端Poly(A)尾核苷酸片段，但反应体系中仍存在较多短的mRNA片段，经质谱检测后TIC图会较复杂，给数据分析带来一定的影响。本专利技术在mRNA样品前处理、消化酶和简化实验流程等方面进行了优化，以进一步提高检测方法的可靠性。经过优化后，特定内切核糖核酸酶切割位点的目标物响应度明显提高。具体地，本专利技术包括以下内容。
[0013]本专利技术的第一方面，提供一种测定mRNA 3
’
Poly(A)尾长度及其分布的方法，其包括以下步骤：(1) 将mRNA进行变性；(2) 使变性后的mRNA与内切核糖核酸酶在适于酶切的条件下孵育；(3) 确定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种测定mRNA 3
’
Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1) 将mRNA进行变性；(2) 使变性后的mRNA与内切核糖核酸酶在适于酶切的条件下孵育；(3) 确定mRNA 3
’
Poly(A)尾长度及其分布。2. 根据权利要求1所述的测定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在于，步骤(1)的变性条件包括在75
‑
98℃处理所述mRNA，变性时间为0.5
‑
5min。3. 根据权利要求1所述的测定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在于，步骤(2)中，适于酶切的条件包括在30
‑
45℃使用所述内切核糖核酸酶处理所述变性后的mRNA，时间为10
‑
40min。4. 根据权利要求3所述的测定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在于，用于所述酶切的体系包括：0.1
‑
2 mg/mL的内切核糖核酸酶、10
×
RNase H buffer和10
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1000 pmol的变性后的mRNA。5. 根据权利要求1
‑
4任一项所述的测定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在于，所述内切核糖核酸酶为核糖核酸酶A。6. 根据权利要求1所述的测定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在于，在步骤(3)中，使用液相色谱质谱联用确定mRNA 3
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Poly(A)尾长度及其分布。7. 根据权利要求6所述的测定mRNA 3
’
Poly(A)尾长度及其分布的方法，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕能铭，张武，莫子瑶，
申请(专利权)人：启辰生生物科技珠海有限公司，
类型：发明
国别省市：