本发明专利技术公开了一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法。具体的是在大肠杆菌中异源表达来自拟无枝酸菌的香兰素合成基因Ech、Fcs以及在香兰素自诱导启动子调控下的阿魏酸转运蛋白Todx编码基因、香兰素转运蛋白PP_0179编码基因，并通过分批发酵生产香兰素，利用该方法进行摇瓶发酵在24h内产生香兰素1.52mM，相比对照菌株提高了1.57倍，且菌株耐受性有所提高，发酵液中的细胞浓度与对照菌株相比提高1.39倍。细胞浓度与对照菌株相比提高1.39倍。细胞浓度与对照菌株相比提高1.39倍。
【技术实现步骤摘要】
一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法
[0001]本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法。
技术介绍
[0002]香兰素具有独特的奶油香草香味，是目前世界上产量最大的广谱型香料品种之一，被广泛应用于食品、医药、日用化工和农业等领域，具有非常重要的经济价值。以可再生天然底物为原料经微生物法合成的香兰素，质量接近天然产品且生产成本较低，成为一种有前景的绿色合成方法。
[0003]以大肠杆菌为底盘，利用香兰素合成关键酶阿魏酸辅酶A合成酶(FCS)及阿魏酸辅酶A水合酶/醛缩酶(ECH)构建微生物细胞工厂，转化可再生底物阿魏酸生成香兰素是香兰素生物合成的重要发展方向之一。但转化过程底物进胞慢、产物对底盘细胞具有抑制作用，极大限制了细胞工厂的生产能力。因此，利用大肠杆菌细胞工厂高效可持续地生产香兰素仍面临巨大的挑战。研究表明，通过调控芳烃类化合物转运蛋白的表达和活性，可动态调节细胞内芳香族化合物的浓度，有效提高微生物对芳香化合物耐受性并促进产物的分泌。香兰素外向转运蛋白有助于增加微生物的香兰素耐受性并有效避免香兰素进一步降解，而阿魏酸内向转运蛋白可从环境中高效摄入底物阿魏酸。将上述转运蛋白引入大肠杆菌细胞工厂中，并利用香兰素自诱导启动子设计构建香兰素自调节双向转运系统，可解决制约细胞工厂生产香兰素的瓶颈问题，有效提升合成效率。而目前尚未有通过以大肠杆菌为底盘细胞构建香兰素自调节双向转运系统提高香兰素产量的相关报道。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在提供一种大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统的方法以提高香兰素产量的应用。
[0005]本专利技术采用的技术方案是：
[0006]一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
[0007](1)获得目的基因；
[0008](2)构建重组载体；
[0009](3)将重组载体转化至大肠杆菌，在大肠杆菌中异源表达来自拟无枝酸菌的香兰素合成基因ech
R37M
、fcs以及在香兰素自诱导启动子调控下的阿魏酸转运蛋白Todx编码基因、香兰素转运蛋白PP_0179编码基因，得到含有香兰素自调节双向转运系统得大肠杆菌；
[0010](4)通过发酵步骤(3)得到得香兰素自调节双向转运系统的大肠杆菌生产香兰素，即得。
[0011]所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的
方法，其特征在于，步骤(1)所述的目的基因为fcs基因及ech
R37M
基因；制备方法为：首先分别获取FCS、ECH蛋白序列信息，将ECH蛋白第37位精氨酸被替换为甲硫氨酸，按照大肠杆菌优势密码子的使用原则优化基因序列，而后分别由引物fcs
‑
F/R、ech
‑
F/R进行PCR扩增并进行琼脂糖胶回收，分别得到fcs基因及ech
R37M
基因。
[0012]所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，所述的重组载体为pETuet
‑
Ech
‑
Fcs
‑
adh7
‑
Todx
‑
PP_0179，步骤(2)中是将ech
R37M
、fcs、todx、pp_0179基因及adh7启动子通过Gibson连接至pETuet
‑
1载体构建而得重组载体pETuet
‑
Ech
‑
Fcs
‑
adh7
‑
Todx
‑
PP_0179。
[0013]所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，步骤(4)的发酵方法为：将过夜培养的大肠杆菌种子液以1.2
‑
1.4％接种量接种于发酵培养基中，30
‑
35℃220
‑
250rpm培养，IPTG诱导剂终浓度为1
‑
1.2mM，底物阿魏酸终浓度为10
‑
11mM。
[0014]所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，所述的发酵培养基为LB培养基，其中含有胰蛋白胨10
‑
12g/L，酵母提取物5
‑
6g/L，氯化钠10
‑
12g/L，其余成分为去离子水。
[0015]所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，在步骤(2)中所述的ech
R37M
、fcs基因位于强启动子的调控下，Todx、PP_0179基因位于香兰素诱导型启动子的调控下。
[0016]所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，所述强启动子为P
T7
，香兰素诱导型启动子为P
adh7
。
[0017]SEQ ID NO.1核酸序列中包含todxpp_0179、adh7三种基因的序列，编号1
‑
911为adh7核酸序列；编号912
‑
2270为todx核酸序列；编号2271
‑
3689为pp_0179核酸序列
[0018]本专利技术有益效果如下：
[0019](1)本专利技术在以大肠杆菌为底盘细胞的香兰素合成途径中，通过在香兰素诱导型启动子adh7调控下表达阿魏酸转运蛋白Todx、香兰素转运蛋白PP_0179，构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量及底盘细胞对香兰素的耐受性。
[0020](2)在本申请的技术方案中，阿魏酸转运蛋白过表达可增加胞内阿魏酸浓度，提高底物在胞内的利用率；香兰素转运蛋白过表达可促进底盘细胞对香兰素的耐受性，同时通过产物的及时外排减少产物抑制、促进香兰素的合成；采用香兰素诱导型启动子adh7启动各转运蛋白基因，可有效控制转运蛋白的表达量，避免转运蛋白大量表达造成菌株代谢负担较大，从而影响菌株的正常生长。本专利技术方法可提高香兰素的产量(提高1.57倍)且增加了培养基中菌液的浓度(OD
600
提高1.39倍)。
附图说明：
[0021]图1：pETuet
‑
Ech
‑
Fcs
‑
adh7
‑
Todx
‑
PP_0179载体图谱
[0022]图2：摇瓶分批发酵过程中细胞生长浓度变化图
[0023]图3：摇瓶分批发酵香兰素通过浓度来展示得产量对比图，其中竖坐标是香兰素的浓度，横坐标中左边柱代表pETuet
‑
Ech
‑
Fc本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：(1)获得目的基因；(2)构建重组载体；(3)将重组载体转化至大肠杆菌，在大肠杆菌中异源表达来自拟无枝酸菌的香兰素合成基因ech
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、fcs以及在香兰素自诱导启动子调控下的阿魏酸转运蛋白Todx编码基因、香兰素转运蛋白PP_0179编码基因，得到含有香兰素自调节双向转运系统得大肠杆菌；(4)通过发酵步骤(3)得到得香兰素自调节双向转运系统的大肠杆菌生产香兰素，即得。2.权利要求1所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，步骤(1)所述的目的基因为fcs基因及ech
R37M
基因；制备方法为：首先分别获取FCS、ECH蛋白序列信息，将ECH蛋白第37位精氨酸被替换为甲硫氨酸，按照大肠杆菌优势密码子的使用原则优化基因序列，而后分别由引物fcs
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F/R、ech
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F/R进行PCR扩增并进行琼脂糖胶回收，分别得到fcs基因及ech
R37M
基因。3.权利要求1所述的一种在大肠杆菌中构建香兰素自调节双向转运系统以提高香兰素产量的方法，其特征在于，所述的重组载体为pETuet
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Ech
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Fcs
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adh7
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Todx
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PP_0179，步骤(2)中是将ech
R37M
、fcs、todx、pp_0179基因及adh7启动子通过Gibson连接至pETuet
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1载体构建而得重组载体pETuet
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Ech
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Fcs
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adh7
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【专利技术属性】
技术研发人员：辛凤姣，李真，孙立娜，邵淑丽，
申请(专利权)人：中国农业科学院农产品加工研究所，
类型：发明
国别省市：
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