一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌，其特征在于，其是将用m2启动子控制的基因pct

【技术实现步骤摘要】
一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于生物工程
，具体地讲，涉及一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌及其构建方法及应用。

技术介绍

[0002]目前，常用的塑料大多是由石油和天然气等化石燃料合成的，导致了全球变暖及固体废弃物积累等环境问题，这些问题催促我们开发利用可持续的原料生产生物基聚合物。聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxy alkanoates,PHA)是由微生物产生的一种聚酯，目前因其生物可降解性、光学性能和生物相容性等优良性质引起了研究者的广泛关注。
[0003]聚乳酸是一种很有前景的生物质衍生聚合物，因为它可以替代石油基塑料，具有几种理想的性质，如生物降解性，生物相容性和可堆肥性，聚乳酸本身无毒，但是传统生化方法生产中的金属催化剂残留会影响其在医学等方面的应用。可惜目前由于缺乏天然的乳酸聚合酶，无法实现在生物体内一步生产。Seiichi Taguchi等利用底物相似性原则，通过对PHA合成酶进行突变成功地创造了微生物生物合成乳酸基聚酯的体系——聚3羟基丁酸乳酸酯P(3HB
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co
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LA)。
[0004]聚3羟基丁酸乳酸酯[P(3HB
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co
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LA)]，是PHA家族的一种，该聚合物融合了单独的聚乳酸透明但是坚硬以及聚3
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羟基丁酸不透明且易碎的特点。由于P(3HB
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co
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LA)是根据乳酸含量来表现不同的弹性和透明度，因此需要调控聚合物中的乳酸组分。
[0005]P(3HB
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co
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LA)由经过突变的具有乳酸聚合活性的PHA合成酶催化3
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羟基丁酰辅酶A(3HB
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CoA)和乳酰辅酶A(LA
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CoA)合成。为了进一步提高乳酸组分含量，研究者尝试经过厌氧发酵使前体物质乳酸积累量增加，结果聚合物中乳酸的摩尔比大幅度增加到47mol％，但由于厌氧状态对于细胞生长有一定的阻碍作用，使得聚合物干重有所下降，仅占菌体的2wt％。Nduko等尝试对碳源优化，以木糖作为碳源时，在改造后的大肠杆菌细胞合成的聚合物中，乳酸组分达到34mol％，相比于在葡萄糖中的26mol％有了较大幅度提升，当对PHA合成酶进一步优化后，乳酸组分再次提高到60mol％。
[0006]之前的研究都集中于单一的提高聚合物中的乳酸组分，但是所得聚合物中的乳酸组分都是固定的，不能灵活调控乳酸组分，这种的单一生产策略很难满足市场对具有不同材料学性质聚合物的需求。
[0007]中国专利申请文献CN110295188A公开了一种提高大肠杆菌合成的聚(3
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羟基丁酸
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co
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乳酸)中乳酸组分含量的方法，以E.coli MG1655为宿主，以启动子trc控制phaA、phaB、phaCm基因的重组表达，以阿拉伯糖启动子控制pct
cp
基因的重组表达构建获得重组大肠杆菌E.coli MG
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01，在此基础上敲除黄素异戊烯基转移酶基因ubiX，和/或敲除D
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乳酸脱氢酶基因dld，和/或替换表达丙酰辅酶A转移酶pct
cp
的启动子为组成型的ldhA启动子，并没有从动态调控乳酸组分的角度进行改造。因此，无法将乳酸组分直接提高到一个很高的比例。

技术实现思路

[0008]本专利技术从动态调控乳酸组分的角度出发，为P(3HB
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co
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LA)的多样化生产提供了更好的平台和调控手段。本专利技术所应用的策略为“代谢晶体管”策略。“代谢晶体管”策略是基于生物合成途径的网络拓扑结构而建立的，该策略通过调节某些新引入的节点处的流量分配，可以控制某些生物合成途径。本专利技术用该策略来调控辅酶Q8的合成过程。辅酶Q8，作为在电子供体(如NADH脱氢酶，琥珀酸脱氢酶)和最终的电子受体(如细胞色素氧化酶或还原酶)之间传递还原当量的物质，是呼吸链的重要组成元素。本专利技术利用lepgt基因来动态控制辅酶Q8的合成进而能有效控制细胞呼吸链水平。通过基于大肠杆菌的“代谢晶体管”策略，在有氧条件下可以产生较多的乳酸。它提供了一种遗传手段，可控制体内电子转移链的活性并控制细胞内NADH的利用率，并控制还原产物的生产，基于这种策略可以调节聚合物中乳酸的组分。敲除细胞色素氧化酶可以有效降低细胞的呼吸链水平。因此，通过利用Red重组技术将WJ01菌株中的cydAB、cyoABCD、cbdAB三个位于电子传递链中的细胞色素氧化酶基因进行敲除，可以显著增强该菌株合成乳酸的能力，扩大lepgt基因对乳酸组分的调控范围。此外，本专利技术的调控方法为灵活调控聚合物中的乳酸组分，而非单一的提高聚合物中的乳酸比例，可以在某一范围内对聚合物的乳酸组分进行精准的调节。而且在不同背景的聚合物生产菌株中应用这个方法，可以实现对该聚合物中乳酸组分的精准调控。
[0009]因此，本专利技术的第一个目的在于，提供可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌。本专利技术的第二个目的在于，提供一种所述的基因工程菌的构建方法。本专利技术的第三个目的在于提供一种上述所述基因工程菌在生产不同乳酸组分的P(3HB
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co
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LA)中的应用。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：
[0011]作为本专利技术的第一个方面，一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌，其是将用m2启动子控制的由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径中的关键酶的编码基因pct
cp
整合至大肠杆菌的基因组上，构建了重组菌株WJ01，然后以重组菌株WJ01为出发菌株，通过钙转化转入pTrc99aABC质粒与pBAD
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PTrc
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lepgt质粒获得生产菌株。
[0012]进一步的，其是以重组菌株WJ01为出发菌株，利用Red重组技术将WJ01菌株中的cyoABCD、cbdAB两个基因进行敲除获得菌株WJ01
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CYO、WJ01
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CBD。
[0013]根据本专利技术，由丙酮酸合成聚羟基丁酸乳酸酯代谢途径中的关键酶为PHA合成酶突变体。
[0014]进一步的，所述基因pct
cp
的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0015]作为本专利技术的第二个方面，一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0016]步骤一、将用m2启动子控制的基因pct
cp
整合至大肠杆菌的基因组上，构建了重组菌株WJ01；
[0017]步骤二、以重组菌株WJ01为出发菌株，通过钙转化转入pTrc99aABC质粒与pBAD
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PTrc
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌，其特征在于，其是将用m2启动子控制的基因pct
cp
整合至大肠杆菌的基因组上，构建了重组菌株WJ01，然后以重组菌株WJ01为出发菌株，通过钙转化转入pTrc99aABC质粒与pBAD
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PTrc
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lepgt质粒获得生产菌株。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，其是以重组菌株WJ01为出发菌株，利用Red重组技术将WJ01菌株中的cyoABCD、cbdAB两个基因进行敲除获得菌株WJ01
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CYO、WJ01
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CBD。3.如权利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因pct
cp
的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示。4.一种可调控聚羟基脂肪酸酯中乳酸组分含量的基因工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、将用m2启动子控制的基因pct
cp
整合至大肠杆菌的基因组上，构建了重组菌株WJ01；步骤二、以重组菌株WJ01为出发菌株，通过钙转化转入pTrc99aABC质粒与pBAD
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PTrc
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lepgt质粒，构建获得。5.如权利要求4所述的构建方法，其特征在于，步骤一的基因pct
cp
的基因组整合的步骤如下：A、以大肠杆菌MG1655为模板，用核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物Pct
‑1‑
F和Pct
‑1‑
R进行PCR扩增，获得片段Pct
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1；B、以带有基因pct
cp
的质粒为模板，用核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的引物Pct
‑2‑
F和Pct
‑2‑
R进行PCR扩增，获得片段Pct
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2；C、以大肠杆菌MG1655为模板，用核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物Pct

【专利技术属性】
技术研发人员：吴辉，吴榉，龚玄，罗远婵，郭鹏业，卢觉枫，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：