5-氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法及使用方法技术

本发明专利技术公开的５－氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，步骤如下：用ＬＢ培养基平板活化保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．１９３９工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）－ｐＥＴ２８ａ－Ｒ．Ｓ．ｈｅｍＡ；将平板上的单克隆接种于ＬＢ培养基摇瓶中培养，将得到的种子接种于ＬＢ培养基的摇瓶中发酵培养，用异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷降温诱导，收获菌体；菌体经离心和超声破胞，分离获得重组的ＡＬＡ合成酶和ＡＬＡ脱水酶；使用不同糖类物质作为添加剂，筛选对ＡＬＡ脱水酶具备抑制作用，同时对ＡＬＡ合成酶没有抑制作用的糖类抑制剂木糖。本发明专利技术的ＡＬＡ脱水酶抑制剂属于生物质资源，对环境友好，用于发酵生产ＡＬＡ，可使产量明显提高。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
５－氨基乙酰丙酸脱水酶抑制剂的筛选方法，其步骤为：　１）用接种针从保藏编号为ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．１９３９工程菌Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）－ｐＥＴ２８ａ－Ｒ．Ｓ．ｈｅｍＡ的甘油管中蘸取菌液，在含有３０－４０μｇ／ｍｌ卡那霉素和３０－４０μｇ ／ｍｌ氯霉素的ＬＢ培养基平板上划线后，置于３７℃烘箱中过夜培养；　２）将平板上的单克隆接种于含３０－５０ｍｌ　ＬＢ培养基的２５０ｍｌ摇瓶中，转速为２００－２２０ｒｍｐ，在３７℃培养７－１０ｈ得到种子；　３）取２ｍｌ－４ｍｌ种子接 种于含１００－１５０ｍｌ　ＬＢ培养基的５００ｍｌ的摇瓶中，起始培养温度为３７℃，２ｈ后降至２７－２９℃，再用０．０５－０．２ｍｍｏｌ／Ｌ异丙基－β－Ｄ－硫代半乳糖苷诱导；　４）诱导培养４－８ｈ，在菌体密度ＯＤ↓［６００］达到３－５时， 收获菌体；　５）菌体经离心和超声破胞后获得粗酶液，亲和层析分离粗酶液获得重组的５－氨基乙酰丙酸合成酶，提取５－氨基乙酰丙酸合成酶后的粗酶液经凝胶过滤层析获得５－氨基乙酰丙酸脱水酶；　６）将糖类物质添加到５－氨基乙酰丙酸合成酶的水 溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类物质的５－氨基乙酰丙酸合成酶的水溶液比较酶的活力，筛选对５－氨基乙酰丙酸合成酶的活力没有抑制作用的糖类；再将筛选得到的糖类添加到５－氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液中，并测定酶的活力，与不添加糖类的５－氨基乙酰丙酸脱水酶的水溶液比较酶的活力，筛选具有抑制５－氨基乙酰丙酸脱水酶活力作用的糖类，即为５－氨基乙酰丙酸脱水酶的抑制剂。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林建平，傅维琦，岑沛霖，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]