一种基于LC-MS对On-DNA化学反应中DNA损伤的分析方法技术

本申请涉及DNA编码化合物库领域，具体公开了一种基于LC

【技术实现步骤摘要】
一种基于LC
‑
MS对On
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DNA化学反应中DNA损伤的分析方法


[0001]本申请涉及DNA编码化合物库
，更具体地说，它涉及一种基于LC
‑
MS对On
‑
DNA化学反应中DNA损伤的分析方法。

技术介绍

[0002]DNA编码库(DELs)最初是由Brenner和Lerner于1992年提出的概念，目前在早期药物筛选发现中已经成为一个重要的识别工具。DELs每个分子上都有独特的DNA标签，可以快速、并行地筛选数百万至数百亿种化合物。近年来，构建DEL文库的合成方法(也称On
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DNA化学反应)发展迅速，现在已经开发了来自有机化学的广泛反应。然而，随着反应类型的增多，与DNA的副反应也在不断发生。作为DNA序列编码多样性的一部分，修饰的碱基可能导致包括突变、移位、断裂等在内的各种DNA损伤，最终导致可扩增编码DNA的显著损失，造成后期PCR过程的中止，从而降低表观DNA浓度并对信号产生负面影响。
[0003]人们已经开发了几种方法来量化化学反应引起的部分DNA损伤，大多数传统的检测DNA损伤的方法要么是全局的、与序列无关的方式，要么局限于一种或几种确定的DNA损伤类型。比如目前较为公认的Sanger测序和qPCR。
[0004]Sanger测序是指在DNA复制过程中加入双脱氧核甘三磷酸(ddNTP)产生一系列末端终止的DNA链，通过电泳和相应仪器可以读出DNA长度和序列。Sanger测序可以报告显著的点突变，但它不能量化不太频繁的点突变，因此不适用于DNA序列仅几十bp的DEL文库。
[0005]qPCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。但该方法有很大劣势，比如：1.qPCR需要在起始阶段对标准品和样品的浓度归一。但是样品在化学反应后产生损伤，分子量可能发生改变，因此样品往往是混合物，无法准确测量其浓度。2.qPCR的扩增效率和特异性与很多因素有关(引物，扩增温度，扩增子长度等)，因此qPCR在实践中往往需要耗费大量的人力物力来优化程序，这对于动辄几百种的DNA化学反应是不合适的，其需要大量的劳动来确定单个样本的扩增效率和标准化程序，并不适合高通量分析。3.qPCR仅提供一个相对的回收率，无法分析具体的DNA损伤类型，比如扩增子中经常发生单个或多个碱基的突变，但这并不影响qPCR的扩增。
[0006]鉴于此，现在急需一种能够快速、准确的量化化学反应引起的部分DNA损伤的分析方法。

技术实现思路

[0007]为了解决上述技术问题，本申请提供一种基于LC
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MS对On
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DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其通过LC
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MS进行检测分析，可通过外标法快速计算On
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DNA化合物回收率，同时由于内参样品和标准品都不参与任何化学反应，因此通过LC
‑
MS提供的样品分子量和信号强度的改变，可以在一天内完成对数百种反应类型的DNA损伤鉴定，这对于DEL文库的后期筛选及高通量分析有重要意义。
[0008]本申请采用如下的技术方案：第一方面，本申请提供一种基于LC
‑
MS对On
‑
DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其包括：选取用于进行On
‑
DNA化学反应的DNA标签，作为内参样品；选择特定的DNA片段作为标准品，且标准品的LC
‑
MS图谱与内参样品的LC
‑
MS图谱中的检测信号响应不重合；配制一组含有标准品与内参样品的标准液，标准液中标准品与内参样品的摩尔比依次递减；将标准液进行LC
‑
MS分析，以标准品与内参样品的摩尔比为横坐标，以标准品与内参样品的LC
‑
MS的检测信号响应的比值为纵坐标，进行回归分析，得到标准工作曲线；利用内参样品进行On
‑
DNA化学反应后，对反应液进行前处理，得到待测样品液，再与标准品混合后，在相同条件下进行LC
‑
MS分析，得到检测信号响应，带入标准工作曲线，计算得到待测样品液中内参样品的物质的量，从而得到内参样品的回收率，并通过回收率以及内参样品的检测信号响应的变化来判断内参样品的DNA损伤情况。
[0009]进一步地，在制作标准工作曲线时，检测信号响应为LC
‑
MS检测图谱中的UV信号峰和Mass信号峰的峰面积或峰高。
[0010]进一步地，在制作标准工作曲线时，纵坐标的检测信号响应的比值＝标准品的(UV峰面积
×
Mass峰面积)/内参样品的(UV峰面积
×
Mass峰面积)。
[0011]进一步地，标准品和内参样品皆为DNA或On
‑
DNA化合物，且内参样品与标准品的液相色谱峰的分离度>1.5，且质谱峰不重合。
[0012]进一步地，在制备内参样品的过程中，采用氨基保护基团对作为DNA标签进行氨基保护处理。
[0013]进一步地，在制备内参样品时采用的氨基保护基团包括乙酰基、邻苯二甲酰基、对甲苯磺酰基、三氟乙酰基、硝基苯磺酰基中的至少一种。
[0014]进一步地，内参样品的结构为：
[0015]进一步地，标准液中标准品的物质的量为1pmol
‑
1nmol，内参样品的物质的量为1pmol
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100nmol。
[0016]进一步地，分析方法还包括：配置含有内参样品的阴性对照液，将阴性对照液与标准品混合，在相同条件下进行LC
‑
MS分析，得到检测信号强度，带入标准工作曲线，计算得到阴性回收率。
[0017]进一步地，LC
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MS的色谱条件为：流动相A：通过将六氟异丙醇、二异丙基乙胺和EDTA溶解在水里得到；流动相B：甲醇；
流速：0.3～0.8mL/min；检测波长：250～270nm；电喷雾电离探针温度为280～320℃，源温度为330～370℃；ESI毛细管为
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18～
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22kV；质量检测器在700
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2000(m/z)范围内以负离子全扫描模式运行。
[0018]综上，本申请具有以下有益效果：1.本申请提供的这种分析方法，通过LC
‑
MS和外标法制作能够代表标准品与内参样品线性关系的标准工作曲线，对利用内参样品进行On
‑
DNA化学反应后的内参样品的回收率进行定量分析。
[0019]2.由于本申请的内参样品中DNA标签，不参与化学反应，因此内参样品分子量的改变是源自于DNA链的改变(突变、移位、断裂)，而非DNA化学结构的改变。因此可通过内参样品的检测信号响应的变化(如Mass中分子离子峰的荷质比、UV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LC
‑
MS对On
‑
DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其特征在于，其包括：选取用于进行On
‑
DNA化学反应的DNA标签，作为内参样品；选择特定的DNA片段作为标准品，且所述标准品的LC
‑
MS图谱与所述内参样品的LC
‑
MS图谱中的检测信号响应不重合；配制一组含有所述标准品与所述内参样品的标准液，所述标准液中标准品与内参样品的摩尔比依次递减；将所述标准液进行LC
‑
MS分析，以标准品与内参样品的摩尔比为横坐标，以标准品与内参样品的LC
‑
MS的检测信号响应的比值为纵坐标，进行回归分析，得到标准工作曲线；利用所述内参样品进行On
‑
DNA化学反应后，对反应液进行前处理，得到待测样品液，再与标准品混合后，在相同条件下进行LC
‑
MS分析，得到检测信号响应，带入所述标准工作曲线，计算得到待测样品液中所述内参样品的物质的量，从而得到所述内参样品的回收率，并通过所述回收率以及所述内参样品的检测信号响应的变化来判断所述内参样品的DNA损伤情况。2.根据权利要求1所述的基于LC
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MS对On
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DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其特征在于，在制作所述标准工作曲线时，所述检测信号响应为LC
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MS检测图谱中的UV信号峰和Mass信号峰的峰面积或峰高。3.根据权利要求2所述的基于LC
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MS对On
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DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其特征在于，在制作所述标准工作曲线时，所述纵坐标的检测信号响应的比值＝标准品的(UV峰面积
×
Mass峰面积)/内参样品的(UV峰面积
×
Mass峰面积)。4.根据权利要求1所述的基于LC
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MS对On
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DNA化学反应中DNA损伤的分析方法，其特征在于，所述标准品和所述内参样品皆为DNA或On
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DNA化合物，且所述内参样品与所述标准品的液相色谱峰的分离度&a...

【专利技术属性】
技术研发人员：马杭柯，胡允金，薛丽俊，孙兆美，袁晶玉，陈冰馨，俞佳清，杨珂新，
申请(专利权)人：康龙化成北京新药技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：