一种鱼类灭活病毒疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法及制备的鱼类灭活病毒疫苗。该方法包括：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量

【技术实现步骤摘要】
一种鱼类灭活病毒疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术涉及病毒灭活、疫苗制备
，具体涉及一种鱼类灭活病毒疫苗以及通过电子束辐照制备该鱼类灭活病毒疫苗的方法。

技术介绍

[0002]通过注射疫苗来预防病原感染，是具有特异性免疫系统的动物行之有效的无公害疾病防治技术。这一技术方法在鱼类中同样适用。一般地，鱼类疫苗多为灭活病毒疫苗，其特点是制备工艺简单、成熟，根据特定区域鱼类疾病，现制现用。
[0003]目前国内的灭活型鱼类疫苗多采用化学灭活技术，该灭活技术稳定可靠，通过使病毒表面蛋白变性等方式实现的，但这也导致了病毒免疫原性较低，制备的成品疫苗的有效性降低等缺陷，诱发鱼体产生抗体效价较低；同时，鱼类组织蛋白对病毒抗原起到干扰作用。病毒通过化学灭活后，直接注射到未患病鱼体内。传统的辐射法处理病毒，在灭活病毒的同时，同样会造成病毒表面蛋白构象的改变，从而降低其免疫原性，该方法目前通常应用于消毒灭菌领域。因此仅仅使用辐射法生产鱼类疫苗，其技术上并不占优，因此，国内外研究者甚少。
[0004]针对传统的热灭活或化学灭活病毒制备疫苗中所存在的问题，以及单纯的通过辐照灭菌手段的来灭活病毒，同样造成免疫原性较低的现状，亟需通过电子束(Electron beam,EB)辐照技术来开发出新的鱼类病毒灭活工艺，从而获得全新的灭活型病毒疫苗的制备方法。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法及制备的鱼类灭活病毒疫苗。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]本专利技术的第一方面是提供一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法，其包括如下步骤：
[0008]步骤一，病毒D
10
值的建立：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量
±
0.15kGy计为该病毒的D
10
值；
[0009]步骤二，按照以下公式计算灭菌剂量SD值：
[0010]SD＝kD
10
Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10
‑6，k为安全系数且k≥1；
[0011]步骤三，辐照：按照辐照累计剂量≥SD值，对上述终浓度为初始滴度的纯化后的鱼类相关病毒样本进行小剂量多次辐照；
[0012]步骤四，低温脱盐和除菌，最后进行无菌灌装。
[0013]进一步地，上述初始浓度为10
3～
104TCID
50
，优选为105TCID
50
。
[0014]进一步地，步骤一中稀释采用的稀释液中添加有半乳糖、D
‑
异抗坏血酸钠和亚硝
酸钠。
[0015]进一步地，半乳糖的浓度为1～3％，优选为2％。
[0016]进一步地，D
‑
异抗坏血酸钠的浓度为4～7
‰
，优选为5
‰
。
[0017]进一步地，亚硝酸钠的浓度为0.5
‑
2.0
‰
，优选为1
‰
。
[0018]进一步地，步骤一中的辐照条件为：将病毒稀释液梯度降温至
‑
20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
[0019]进一步地，梯度辐照剂量为0.2kGy、0.4kGy、0.6kGy、0.8kGy、1.0kGy、1.2kGy、1.4kGy、1.6kGy。
[0020]进一步地，k＝1。
[0021]进一步地，步骤三中每次辐照的剂量不超过3kGy。
[0022]进一步地，步骤三中将病毒样本梯度降温至
‑
20℃，采用能量为10MeV的电子加速器进行梯度辐照。
[0023]进一步地，步骤三中辐照完成后，梯度升温至0～10℃。
[0024]进一步地，步骤三中还包括对辐照完成的病毒样本进行灭活效果测试。
[0025]本专利技术的第二方面是提供上述方法制备的鱼类灭活病毒疫苗。
[0026]本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0027]本专利技术采用电子束对鱼类病毒进行辐照灭菌、灭活操作，灭活后的病毒免疫原性高，产品性能均一，稳定性好，批次内与批次间差异小，产品性能可靠性更佳；且本专利技术提供的处理方法，可以最大限度克服由于传统灭活方式造成的病毒表面蛋白、多肽、多糖等生物活性物质活性不可逆的破坏。该方法创造性的实现了辐照灭活制备疫苗的工艺，有助于提升鱼类疫苗产能与品质。
附图说明
[0028]图1显示了本专利技术一实施例中GiCF细胞感染CyHV
‑
2病毒以及CyHV
‑
2灭活病毒的细胞病变过程；图1(a)代表正常GiCF细胞培养第1、3、7天的状态；图1(b)代表GiCF细胞感染阳性对照病毒后第1、3、7天的出现细胞病变效应的状态，图1(b3)代表阳性对照病毒感染GiCF细胞后第3天出现CPE的状态，图1(b7)代表阳性对照病毒感染GiCF细胞7天后细胞死亡从细胞培养瓶瓶底脱落超过90％的情况；图1(c1,c3,c7)为1.3kGy EB辐照后病毒感染实验，1
‑
3天GiCF细胞并未出现病感染现象，第7天发现出现CPE现象，约半数细胞死亡并脱落；图1(d1,d3,d7)为6.6kGy EB辐照后病毒感染实验组，1
‑
7天都未发现细胞出现CPE现象，即可说明辐照后病毒已无感染能力；
[0029]图2显示了本专利技术一实施例中不同辐照剂量下EB辐照前后CyHV
‑
2病毒DNA拷贝数的变化；
[0030]图3显示了本专利技术一实施例中SDS
‑
PAGE检测EB辐照后CyHV
‑
2病毒蛋白的结果，其中M表示ladder，1～6分别显示阳性对照组、以及辐照剂量为6.0、6.2、6.4、6.6、6.8的处理组；
[0031]图4显示了本专利技术一实施例中电子束灭活的抗原与抗血清结合的ELISA试验结果。
具体实施方式
[0032]本专利技术提供了一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法，其包括如下步骤：
[0033]步骤一，病毒D
10
值的建立：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量
±
0.15kGy计为该病毒的D
10
值；
[0034]步骤二，按照以下公式计算灭菌剂量SD值：
[0035]SD＝kD
10
Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10
‑6，k为安全系数且k≥1；
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过电子束辐照制备鱼类灭活病毒疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一，病毒D
10
值的建立：取分离纯化后的鱼类相关病毒稀释至设定终浓度，计为初始滴度；然后对病毒进行梯度辐照直至病毒滴度下降至初始滴度的1/10，将对应的辐照总剂量
±
0.15kGy计为所述病毒的D
10
值；步骤二，按照以下公式计算灭菌剂量SD值：SD＝kD
10
Lg(N0/N)，其中，N0为初始滴度，N取SAL＝10
‑6，k为安全系数且k≥1；步骤三，辐照：按照辐照累计剂量≥SD值，对终浓度为所述初始滴度的纯化后的鱼类相关病毒样本进行小剂量多次辐照；步骤四，低温脱盐和除菌，最后进行无菌灌装。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述初始浓度为10
3～
104TCID
50
，优选为105TCID
50
。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤一中将分离纯化后的鱼类相关病毒进行扩增培养后，进行滴度的测定；测定的过程中采用的稀释液中添加有半乳糖、D
‑
异抗坏血酸钠和亚硝酸钠。4.根据权利要求3所述的方法，...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏春，宋增福，肖冰冰，郁小娟，张晓飞，陈兴旺，黄敬松，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：