球孢白僵菌ZJB23323及其在合成R-2-(4羟基苯氧基)丙酸中的应用制造技术

本发明专利技术公开了球孢白僵菌ZJB23323及其在合成R

【技术实现步骤摘要】
球孢白僵菌ZJB23323及其在合成R
‑2‑
(4羟基苯氧基)丙酸中的应用


[0001]本专利技术属于微生物
，尤其涉及一种高产R
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(4羟基苯氧基)丙酸的球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZJB23323及其在合成R
‑2‑
(4羟基苯氧基)丙酸中的应用。

技术介绍

[0002]在农林业杂草防治工作中，芳氧苯氧丙酸类除草剂因其高效、低毒、广谱、对后茬农作物安全等优点而倍受青睐，市场前景广阔。R
‑2‑
(4
‑
羟基苯氧基)丙酸(R
‑
HPPA)是合成芳氧苯氧基丙酸类除草剂的关键中间体。因此，如何实现R
‑
HPPA的高效生产是目前亟待解决的问题。
[0003]然而芳香族化合物的选择性羟基化是合成化学中最具挑战性的一种反应。尽管Cleugh团队和Cooper团队以对苯二酚为底物成功合成R
‑
HPPA，但去除副产物的问题极大的阻碍了这种方法的推广使用。与此相反，R
‑
HPPA可以通过由R
‑
PPA与球孢白僵菌进行全细胞反应制备。它能够产生区域选择性氧化酶催化羟基化。为此，高产R
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(4羟基苯氧基)丙酸的菌株能够为企业带来较高的商业利润，而且对芳氧苯氧丙酸类除草剂的普遍应用具有重要意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种高产R
‑
HPPA菌株及应用，实现芳氧苯氧丙酸类除草剂的普遍应用。
[0005]本专利技术公开的高产R
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HPPA菌株为球孢白僵菌(Beauveria bassiana)，微生物菌种保藏编号为ZJB23323。该菌株以Beauveria bassiana ZJB16001为出发菌株(本实验保藏)，经过自然选育，UV诱变，室温等离子(ARTP)诱变亚硝基胍诱变等步骤获得。
[0006]本专利技术解决其技术问题所采取的技术方案是：
[0007]第一方面，本专利技术提供一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZJB23323，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2023584，保藏日期：2023年04月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。
[0008]第二方面，本专利技术还提供一种上述球孢白僵菌ZJB23323在制备R
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(4羟基苯氧基)丙酸中的应用。
[0009]进一步，所述应用为：将所述球孢白僵菌ZJB23323接种于含有R
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2苯氧基丙酸的液体高转化筛选培养基A中，28℃，250r/min振荡培养3天，得到种子液；
[0010]将所述种子液以10％的体积接种量接种于含R
‑
2苯氧基丙酸的液体高转化筛选培养基B中，28℃下进行发酵培养(静置)，所得发酵液经后处理，得到所述R
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(4羟基苯氧基)丙酸。
[0011]液体高转化筛选培养基A和液体高转化筛选培养基B的字母只是为了区分不同阶段的培养基，方便描述，无其它特殊含义。
[0012]进一步，所述液体高转化筛选培养基A和液体高转化筛选培养基B都由以下终浓度的各组分组成：葡萄糖2wt％，酵母提取物1wt％，无水硫酸镁0.097wt％，无水氯化钙0.075wt％，磷酸二氢钾0.075wt％，磷酸氢二钾0.18wt％，R
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2苯氧基丙酸5wt％，微量元素溶液5％v/v；调节pH为6.8，溶剂为水；其中，所述微量元素溶液由以下终浓度的各组分组成：1ml/L 2M硫酸水溶液，2000mg/L乙二胺四乙酸二钠，600mg/L七水硫酸亚铁，200mg/L七水硫酸锌，150mg/L一水硫酸锰，30mg/L硼酸，20mg/L六水氯化钴，40mg/L二水氯化铜，40mg/L二水氯化镍，5mg/L二水钼酸钠，溶剂为水。
[0013]在本专利技术的一个实施例中，所述发酵培养的过程中还需要补充物料，所述发酵培养的总时间为12天，具体过程为：所述发酵培养的过程中还需要补充物料，所述发酵培养的总时间为12天，具体过程为：每两天补加一次蒸发的水，首先在28℃静置培养，第四天开始转移至50rpm，28℃摇床进行培养，其中第六天和第八天各补加一次葡萄糖和R
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2苯氧基丙酸，每次补加葡萄糖的质量为60g/L液体高转化筛选培养基B，每次补加的R
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2苯氧基丙酸的质量为30g/L液体高转化筛选培养基B。
[0014]进一步，所述后处理为：将所述发酵液调节pH至5.5，离心，所得上清用0.22μm纳滤膜过滤，所得滤液加热到75℃，加终浓度为3g/L的活性炭，搅拌40min进行脱色，离心，所得上清液旋蒸浓缩至原体积20
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30％，所得浓缩液经乙酸乙酯萃取，最后蒸发干燥得到R
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(4羟基苯氧基)丙酸。
[0015]进一步，所述冷冻干燥的具体操作为：乙酸乙酯萃取液在120℃蒸发，剩余液体采用无水硫酸钠干燥。
[0016]本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：
[0017](1)使用本专利技术菌株球孢白僵菌ZJB23323进行全细胞催化制备R
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HPPA，底物利用率高，没有多余副产物产生。相比于化学法制备具有生产设备简易，生产工艺简单，下游分离纯化容易等优点。
[0018](2)诱变培育所得球孢白僵菌相比于野生型菌株具有更高的底物耐受性，其可以在100g/L底物的环境下生长。能够转化100g/L以上的底物，转化率100％。
[0019](3)本专利技术所采用的发酵培养工艺，不需昂贵的发酵设备，发酵工艺简单、稳定、重现性好。
附图说明
[0020]图1：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZJB23323菌种选育系谱
[0021]图2：紫外诱变致死率曲线
[0022]图3：ARTP诱变致死率曲线
[0023]图4：亚硝基胍诱变致死率曲线
[0024]图5：不同初始底物浓度发酵产R
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HPPA曲线
[0025]图6：100g/L底物浓度发酵产R
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HPPA曲线(实施例4)
[0026]图7：100g/L底物浓度发酵产R
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HPPA曲线(实施例5)
[0027]图8：发酵结束后液相检测峰图
[0028]图9：球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZJB23323系统发育树图
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本专利技术进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本专利技术的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本专利技术的这些方面。
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种球孢白僵菌(Beauveria bassiana)ZJB23323，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2023584，保藏日期：2023年04月21日，地址：中国，武汉，武汉大学，430072。2.如权利要求1所述的球孢白僵菌ZJB23323在制备R
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(4羟基苯氧基)丙酸中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述应用为：将所述球孢白僵菌ZJB23323接种于含有R
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2苯氧基丙酸的液体高转化筛选培养基A中，28℃，250r/min振荡培养3天，得到种子液；将所述种子液以10％的体积接种量接种于含R
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2苯氧基丙酸的液体高转化筛选培养基B中，28℃下进行发酵培养，所得发酵液经后处理，得到所述R
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(4羟基苯氧基)丙酸。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述液体高转化筛选培养基A和液体高转化筛选培养基B都由以下终浓度的各组分组成：葡萄糖2wt％，酵母提取物1wt％，无水硫酸镁0.097wt％，无水氯化钙0.075wt％，磷酸二氢钾0.075wt％，磷酸氢二钾0.18wt％，R
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2苯氧基丙酸5wt％，微量元素溶液5％v/v；调节pH为6.8，溶剂为水；其中，所述微量元素溶液由以下终浓度的各组分组成：1m...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，赵理想，邹树平，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：