一种PCR引物和探针的设计方法技术

本发明专利技术公开了一种PCR引物和探针的设计方法，包括以下步骤：步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5

【技术实现步骤摘要】
一种PCR引物和探针的设计方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学领域，具体地，涉及一种PCR引物和探针的设计方法。

技术介绍

[0002]除少数病毒外，DNA是大多数生物体的主要遗传物质。细胞中的DNA可能由于环境暴露于某些化学物质、紫外线辐射、其他遗传因素，甚至由于DNA复制和修复过程的缺陷而发生变化。生物体、病毒基因组或染色体外DNA的核苷酸序列的遗传改变称为突变。
[0003]基因突变是基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变，可以发生在发育的任何时期，但通常发生在DNA复制时期，特别是复制时出现的随机性差错，在自然界各物种中普遍存在，并具有随机性。机体细胞具备一系列进化保守而完善的DNA损伤监视和修复体系，可修复DNA损伤，基因突变不会发生，确保基因组稳定和遗传信息连续性。细胞DNA损伤的修复机制一旦发生异常，基因突变的几率增大，将导致严重后果，如对环境因子高度敏感、个体癌症易感性显著增加等。
[0004]基因突变一般可分为碱基置换突变和移码突变两类。碱基置换突变也称为点突变，是指DNA分子中一个碱基对被另一个不同的碱基对取代，可以是一种嘌呤被另一种嘌呤取代或是一种嘧啶被另一种嘧啶取代，也可以是嘌呤取代嘧啶或嘧啶取代嘌呤。DNA片段中某一位点插入或丢失一个或几个(非3的倍数)碱基对时，造成插入或丢失位点以后的一系列编码顺序发生错位的突变是移码突变。DNA复制出现差错时，不能够修复，无论是发生碱基置换突变还是移码突变，都能使多肽链中氨基酸组成或顺序发生改变，进而影响蛋白质或酶的生物功能，使细胞生理功能改变，导致细胞的异常分裂、分化或者被机体免疫系统清除。基因突变是多种因素相互作用的综合结果，机体的内部因素DNA复制过程中，基因内部的脱氧核苷酸的数量、顺序、种类发生局部改变具有普遍性，即受年龄、性别等客观因素影响，又受物理、化学、生物等外部因素的作用，增加基因突变的可能性，改变了基因的遗传信息。
[0005]正是遗传特性的突然变化产生了可变性，使得进化得以继续。如果没有突变，生命就不可能从无机物质中逐渐发展。突变可以发生在不同的规模范围从小(单碱基)到大幅度(多基因)。由于突变引起的遗传变异，特别是在基因的编码区域，显示出极大的影响，导致各种疾病的发展和身体异常。一些突变对机体有益，如免疫球蛋白功能多样性的发展。对生物体有益的突变是由自然选择的，这种突变在基因库中积累。
[0006]因此，准确、快速地检测病毒核酸基因对于控制疾病大流行非常重要。一个新出现的序列变体可以逃避分子分析中的检测。这可能是一个罕见的事件，但如果它发生的影响可能是非常重大的。个体可能被错误地告知他们没有被感染，这可能会增加一种新变种的传播，这在例如SARS
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CoV
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2大流行期间更具挑战性，因为新的序列变体频繁出现。因此那些例如应用RT
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qPCR诊断SARS
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CoV
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2的人意识到基因的突变对他们的监测和RT
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qPCR的结果输出会产生重大影响。
[0007]病毒变异的遗传变化可能导致引物或探针序列不再完美地补充其靶向的遗传区
域。引物和探针结合区域的序列变化可能对PCR性能没有影响，也可能只是边缘影响或者是灾难性的影响。引物或探针的五个主区的序列错配很少影响分析性能，而三个主区的序列错配影响更大。
[0008]PCR易受引物和探针结合位点序列变异的影响，即使是很小的序列变化也可能导致检测失败和假阴性结果。针对单一病原体内两个或多个不同基因的突变位点进行针对性重叠碱基的引物和探针设计的出现为PCR检测提高了检测相关变异的可靠性，因为设计的重叠碱基的引物和探针巧妙地避开了核酸基因的突变位置，受到目标基因突变所带来的影响进一步降低，提高检测的性能。因此，如何准确地对含有突变位点的靶序列进行PCR检测，防止漏检，成为了目前核酸检测，特别是针对病毒的核酸检测要解决的重要问题。目前实验室检测的核酸扩增时间长达1小时以上，如何缩短扩增时间也是当务之急要解决的问题。

技术实现思路

[0009]解决的技术问题：
[0010]本专利技术的一个方面，是针对现有技术中核酸PCR由于存在突变位点导致漏检，以及检测时间长的问题，提供了一种PCR引物和探针的设计方法。
[0011]具体地，本专利技术提供了一种用于跨越基因突变位点的超短扩增序列的引物和探针的设计方法。该技术不但灵敏度高，并且能有效缩短PCR的扩增时间，以及有效避免因基因突变导致的漏检。
[0012]技术方案：
[0013]一种PCR引物和探针的设计方法，包括以下步骤：
[0014]步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5
’
末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5
’
末端反方向间隔1～3bp碱基；
[0015]步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3
’
末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3
’
末端延5
’
方向存在3～5bp碱基的重叠区域。
[0016]一种PCR引物和探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0017]步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5
’
末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5
’
末端延3
’
方向存在3～5bp碱基的重叠区域；
[0018]步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3
’
末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3
’
末端正方向间隔1～3bp碱基。
[0019]在本专利技术中，所述突变包括但不限于点突变、缺失突变或插入突变。上述突变可以存在于，例如在本专利技术的一个实施方式中，在所述探针与待扩增靶序列的互补结合区域或所述重叠区域存在n个突变位点。同时，上述突变可以为多个，例如，n＝1、2、3、4、5、6、7、8、9、10
……
。
[0020]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述正向引物的长度为15～18bp，所述反向引物的长度为13～18bp。
[0021]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述探针的长度为17～22bp。
[0022]在本专利技术中，所述重叠区域的碱基，即探针和引物上相对应的碱基，其序列可以为相同，也可以为不同。当序列不同时，可有效避免探针和反向引物的竞争性结合，影响结合效率。
[0023]在本专利技术中，在所述探针的5
’
端标记有荧光基团，在所述探针的3
’
端标记有与所述荧光基团对应的淬灭基团。
[0024]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述荧光基团为FAM、VIC、HEX或MGB。更优选地，所述荧光基团为MGB。
[0025]为了使所设计的引物具有合适的T
m
值，作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述引本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PCR引物和探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5
’
末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5
’
末端反方向间隔1～3bp碱基；步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3
’
末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3
’
末端延5
’
方向存在3～5bp碱基的重叠区域。2.一种PCR引物和探针的设计方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1)在待扩增靶序列对应的探针的5
’
末端的上游设计正向引物，所述正向引物与所述探针的5
’
末端延3
’
方向存在3～5bp碱基的重叠区域；步骤2)在待扩增靶序列对应的探针的3
’
末端的下游设计反向引物，所述反向引物与所述探针的3
’
末端正方向间隔1～3bp碱基。3.根据权利要求1或2所述的设计方...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨晓涵，王维，彭闯，高智强，王海滨，窦瑞艳，唐洁，石风，
申请(专利权)人：北京纳捷诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：