一种逆转录酶的稳定剂制造技术

本发明专利技术公开了一种逆转录酶的稳定剂，所述稳定剂中包含乙酰化牛血清白蛋白和选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质。本发明专利技术逆转录酶的稳定剂能够使逆转录酶在常温下结构更加稳定，保持良好的生物活性，仓储成本低，能够满足在常温下逆转录酶的运输，大大降低了逆转录酶在运输方面的风险成本。酶在运输方面的风险成本。

【技术实现步骤摘要】
一种逆转录酶的稳定剂


[0001]本专利技术涉及分子诊断
，特别涉及一种新的逆转录酶的稳定剂。

技术介绍

[0002]1970年Temin等在致癌RNA病毒中发现了逆转录酶，并认为此酶与病毒的致癌性质有关。后来发现逆转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中，哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞中也有逆转录酶。逆转录酶的发现表明遗传信息可以从RNA传递到DNA。它促进了分子生物学、生物化学和病毒学的研究，已成为这些学科研究的有力工具。
[0003]逆转录酶主要包括以下三种活性：
①
逆转录活性：以RNA为模板，催化dNTP聚合，生成DNA
‑
RNA杂合双链。
②
RNase H活性：水解杂合双链中的RNA，得到与RNA互补的DNA单链（cDNA）。
③
DNA指导的DNA聚合酶活性：以cDNA单链为模板，以dNTP为底物，再合成双链DNA。
[0004]目前通过深入研究的逆转录酶包含:人类免疫缺陷病毒1型的逆转录（PDB：1HMV）；莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶（MMLV）；禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶（AMV）；维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶。其中MMLV和AMV是分子PCR检测常用的两种逆转录酶，尤其是MMLV最为常见，它一种重组DNA聚合酶，可以从单链RNA、DNA或RNA:DNA杂交中合成互补的DNA链。与AMV 相比，MMLV缺乏DNA内切酶活性，RNase H活性较低。
[0005]近年来，随着分子生物学的发展和科学领域的不断扩充，逆转录酶有了更明显的需求。由于逆转录酶的保存条件比较严格，酶的保存温度一般在0℃
‑
4℃，零度以下溶质的冰晶化可引起盐分浓缩，导致溶液的pH值发生改变，从而可能引起酶巯基间连接成为二巯键，损坏酶的活性中心，并使酶变性。因此保存和运输逆转录酶就成为人们更加关注的问题。
[0006]现有技术中有研究通过BSA乙酰化对逆转录酶的改造，经过改造后，逆转录酶的反应温度虽然可以提高，但其半衰期仍然较短，且其热稳定性还是无法满足使用的要求。因此需要寻找一种新的逆转录酶的处理方法来解决上述问题。

技术实现思路

[0007]本专利技术的一个方面，是针对现有技术中逆转录酶的热稳定性差的缺点，提供了一种逆转录酶的稳定剂。
[0008]本专利技术提供的技术方案为：一种逆转录酶的稳定剂，所述稳定剂中包含乙酰化牛血清白蛋白和选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质。
[0009]在本专利技术中，专利技术人发现，通过乙酰化牛血清白蛋白、选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质与逆转录酶的相互作用，可以使逆转录酶在常温下结构更加稳定，保持良好的生物活性。作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述单糖为选自葡萄糖、核糖、果糖、脱氧核糖或半乳糖中的一种或几种，所述双糖为选自麦芽糖、乳糖或蔗糖中的一种或几种。更优选地，在本专利技术的一个实施方式中，所述单糖为葡聚糖、核糖或脱氧核糖。
[0010]在本专利技术中，所述乙酰化牛血清白蛋白与所述选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质可以以任意合适的比例混合。但为了达到更好的效果，在本专利技术的某些实施方式中，所述乙酰化牛血清白蛋白与所述选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质的质量比为10：1～100：1。
[0011]在本专利技术中，所述乙酰化牛血清白蛋白可以为固体或液体的形式。当所述乙酰化牛血清白蛋白为固体粉末时，在使用中可通过合适的溶剂溶解。作为优选，所述溶剂为水。更优选地，在本专利技术的一个事实方式中，所述溶剂为不含核酸酶的水。
[0012]为了获得更好的效果，在本专利技术的某些实施方式中，所述逆转录酶的稳定剂还可以包含，例如，但不限于，缓冲液、RNA酶抑制剂、DNA酶抑制剂、防腐剂、色素、助溶剂、引物、终止剂，等。
[0013]本专利技术的另一个方面，是提供了一种逆转录酶的处理方法，将逆转录酶与乙酰化牛血清白蛋白和所述选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质按照10：1～100：1的质量比混合并混匀。上述混合可以通过反复颠倒实现充分混匀，也可以通过涡旋振荡实现充分混匀。作为优选，在本专利技术的一个实施方式中，所述乙酰化牛血清白蛋白先与所述选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质混合并混匀后再加入所述逆转录酶混匀。
[0014]优选地，所述逆转录酶为人类免疫缺陷病毒1型的逆转录酶（PDB：1HMV）、莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶（MMLV）、禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶（AMV）或维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶。
[0015]在本专利技术中，所述乙酰化牛血清白蛋白可以通过购买市售商品获得，也可以通过合适的方法进行制备。在本专利技术的某些实施方式中，所述乙酰化牛血清白蛋白的制备方法为：将牛血清白蛋白溶液在碱性环境下与乙酰化试剂进行反应，产物经干燥粉碎后得到所述乙酰化牛血清白蛋白的粉末。
[0016]对蛋白质进行的乙酰化反应是指将供体的乙酰基转移到受体蛋白的末端氨基酸残基（α氨基）或者链中的赖氨酸残基（ε氨基）上的反应。上述反应可以在碱性环境下进行。为了获得更好的效果，所述碱性环境可以为pH值8.0～8.5，利用碱性试剂调节所述pH值。作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述碱性试剂为碳酸钠、碳酸氢钠、亚硫酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、乙酸钠、磷酸钠、次氯酸钠、碳酸氢铵或碳酸钙。更优选地，在本专利技术的某些实施方式中，所述碱性试剂为碳酸钠、碳酸氢钠或亚硫酸钠。
[0017]常用的乙酰化试剂包括羧酸酰化剂、羧酸酯酰化剂、酸酐酰化剂和酰氯酰化剂。作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述乙酰化试剂为乙酰氯、乙酸酐、冰醋酸、N
‑
甲氧基二乙酰胺或三氟乙酰三氟甲磺酸酯。更优选地，在本专利技术的某些实施方式中，所述乙酰化试剂为乙酰氯、乙酸酐或冰醋酸。
[0018]在本专利技术中，专利技术人还研究了不同乙酰化试剂的添加量对牛血清白蛋白乙酰化程度以及对本专利技术中逆转录酶稳定剂效果的影响。专利技术人创造性地发现，随着乙酰化试剂用量的增加，乙酰化程度的提高，乙酰化牛血清白蛋白的功能性综合评价值先快速增加，而后缓慢下降。因此，为了获得更好的效果，在本专利技术的某些实施方式中，当所述乙酰化试剂为乙酸酐时，所述乙酸酐的添加量为所述牛血清白蛋白质量的5%～10%；当所述乙酰化试剂为乙酰氯时，所述乙酰氯的添加量为所述牛血清白蛋白质量的2%～7%；当所述乙酰化试剂为冰醋酸时，所述冰醋酸的添加量为所述牛血清白蛋白质量的5%～13%。
[0019]在本专利技术中，上述乙酰化反应的反应温度可以为
‑
10℃～100 ℃。作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述乙酰化反应的反应温度可以为0℃～40 ℃。
[0020]在本专利技术的某些实施方式中，所获得的乙酰化牛血清白蛋白可以为溶液状态，也可以为固体粉末状态。
[0021]本专利技术的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括逆转录酶和上述稳定剂。除此之外，在本专利技术的某些实施方式中，所述试剂本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种逆转录酶的稳定剂，其特征在于，所述稳定剂中包含乙酰化牛血清白蛋白和选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质。2.根据权利要求1所述的稳定剂，其特征在于，所述单糖为选自葡萄糖、核糖、果糖、脱氧核糖或半乳糖中的一种或几种，所述双糖为选自麦芽糖、乳糖或蔗糖中的一种或几种。3.根据权利要求2所述的稳定剂，其特征在于，所述单糖为葡聚糖、核糖或脱氧核糖。4.根据权利要求1、2或3所述的稳定剂，其特征在于，所述乙酰化牛血清白蛋白与所述选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质的质量比为10：1～100：1。5.一种逆转录酶的处理方法，其特征在于，将逆转录酶与乙酰化牛血清白蛋白和如权利要求1、2或3中所述的选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质按照如权利要求4中所述的质量比混合并混匀。6.根据权利要求5所述的处理方法，其特征在于，所述乙酰化牛血清白蛋白先与所述选自单糖、双糖或ATP中的一种或几种物质混合并混匀后再加入所述逆转录酶混匀；所述逆转录酶为人类免疫缺陷病毒1型的逆转录酶、莫洛尼鼠白血病病毒的逆转录酶、禽成髓细胞瘤病毒的逆转录酶或维持真核细胞的染色体端粒存在的端粒酶逆转录酶。7.根据权利要求5所述的处理方法，其特征在于，所述乙酰化牛血清白蛋白的制备方法为：将牛血清白蛋白溶液在...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海滨，彭闯，杨晓涵，窦瑞艳，高智强，唐洁，王奇，石风，张公安，
申请(专利权)人：北京纳捷诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：