一种用于检测新型冠状病毒RNA的组合物制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测新型冠状病毒RNA的组合物。本发明专利技术的组合物用于标本中新型冠状病毒RNA的检测，其最低检测限可以达到50copies/mL，Ct值标准为38；本发明专利技术试剂盒同时包括内源性内标检测系统、特殊的样本保存液及磁珠，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程的监控，可减少假阴性结果的出现，具有良好的实际应用价值。好的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测新型冠状病毒RNA的组合物


[0001]本专利技术涉及分子诊断领域，特别涉及一种用于检测新型冠状病毒RNA的组合物。

技术介绍

[0002]常用的病原体检测方法有病原体培养、血清抗体检测、核酸检测等，其中病毒培养检测耗时数天，效率过低；血清抗体检测特异性较低。因此临床上最普遍的检测手段是时间更短、特异性更强、灵敏度更高的核酸检测方法。目前已有多种SARS
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CoV
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2的核酸检测方法，包括聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)、环介导的等温扩增、CRISPR/Cas系统等。其中PCR技术是最早发展起来的核酸扩增技术，通过高温变性、低温退火、引物延伸的多次循环可将靶标扩增上万甚至上亿倍。作为一种相对成熟的核酸扩增技术，PCR技术目前已被广泛应用于生命科学的多个领域。
[0003]核酸检测作为临床检验的重要方法，现已是SARS
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CoV
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2的首选检测技术。核酸检测相较于传统的病毒分离检测，具有耗时短、操作简单、实验条件较低、稳定性好等多个优点；相较于常规的抗原和抗体检测，具有灵敏度和特异度高、不存在窗口期且不容易被干扰等优势。
[0004]TaqMan探针法的原理是:在反应体系中加入一种可以与靶标特异性结合的寡核苷酸探针，其两端分别连接荧光基团和淬灭基团，二者共存时由于荧光能量共振转移现象，无荧光产生。在引物延伸的过程中，具有5
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～3
’
外切酶活性的DNA聚合酶会将探针5
’
端的荧光基团切割下来，从而产生荧光。根据扩增循环数(Ct值)，可判断靶标分子的有无。
[0005]SARS
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CoV
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2的遗传物质是单链RNA，其核酸检测过程包括逆转录和PCR扩增两个步骤。首先在逆转录酶的作用下，病毒RNA被逆转录为cDNA，然后DNA聚合酶再对cDNA进行扩增。根据样本扩增曲线的Ct值，即可判断样本中是否含有SARS
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CoV
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2核酸。我国国家卫建委推荐的标准是:Ct值≤37，可报告为阳性；无Ct值或Ct≥40，为阴性；Ct值在37～40，则重复实验。

技术实现思路

[0006]解决的技术问题：
[0007]本公开技术方案解决了现有技术中存在的利用聚合酶链式反应检测新型冠状病毒的产品灵敏度低，且容易出现假阴性结果等问题。
[0008]本专利技术提供的技术方案为：
[0009]一种用于检测新型冠状病毒RNA的组合物，所述组合物包含通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对和通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒N基因的引物对，
[0010]其中，所述通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对的序列为：
[0011]ORF1ab基因上游引物序列：5'
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cacttaaaaacacagtctgtacc
‑
3'，
[0012]ORF1ab基因下游引物序列：5'
‑
gaacccatgcttcagtcagctga
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3'；
[0013]所述通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒N基因的引物对的序列为：
[0014]N基因上游引物序列：5'
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gctagaatggctggcaat
‑
3'，
[0015]N基因下游引物序列：5'
‑
gcttgagagcaaaatgtc
‑
3'。
[0016]为了更好地实现本专利技术的目的，在本专利技术的某些实施方式中，所述组合物还包含通过聚合酶链式反应检测新型冠状病毒ORF1ab基因和/或新型冠状病毒N基因的探针，
[0017]其中，所述检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针的序列为：
[0018]5'
‑
gtggaaaggttatggctgtagttgtgatc
‑
3'；
[0019]所述检测新型冠状病毒N基因的探针的序列为：
[0020]5'
‑
gatgctgctcttgctttgctgctgcttgac
‑
3'。
[0021]在本专利技术中，上述探针上可标记任意合适的荧光基团及淬灭基团。作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述ORF1ab基因的探针的5'末端标记FAM荧光基团，3'末端标记TAMRA淬灭基团；所述N基因的探针的5'末端标记VIC荧光基团，3'末端标记TAMRA淬灭基团。
[0022]本专利技术的另一个方面，是提供了上述组合物在制备检测或筛查样本中的新型冠状病毒RNA的产品中的用途，其中，所述检测或筛查为定性的检测或筛查，或所述检测或筛查为定量的检测或筛查。
[0023]本专利技术的另一个方面，是提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含上述组合物。
[0024]在本专利技术中，所述试剂盒还包含核酸检测试剂盒的常规部分，例如，缓冲液、酶、dNTP、拭子、说明书，等。
[0025]为了减少标本采集、核酸提取过程及PCR扩增过程可能出现的假阴性结果，作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述试剂盒还包括内标RNaseP体系，所述内标RNaseP体系中包含通过聚合酶链式反应扩增RNaseP基因的引物对。
[0026]其中，通过聚合酶链式反应扩增RNaseP基因的引物对的序列为：
[0027]RNaseP基因上游引物序列：5'
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agatttggacctgcgagcg
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3'，
[0028]RNaseP基因下游引物序列：5'
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gagcggctgtctccacaagt
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3'。
[0029]为了更好地实现本专利技术的目的，在本专利技术的某些实施方式中，所述内标RNaseP体系中还包含通过聚合酶链式反应检测RNaseP基因的探针，
[0030]其中，所述检测RNaseP基因的探针的序列为：
[0031]5'
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ttctgacctgaaggctctgcgcg
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3'。
[0032]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述RNaseP基因的探针的5'端标记CY5荧光基团，3'端标记TAMRA淬灭基团。
[0033]作为优选，在本专利技术的某些实施方式中，所述试剂盒还包括核酸样本保存液，所述核酸样本保存液包括一种用于保护RNA的假病毒，所述假病毒的序列为5
’‑
AGTGCCCCGGGAGGTCTCGTAGA
‑3’
。
[0034]更优选地，所述假病毒放置于甜菜碱溶液中，其中，所述甜菜碱溶液中甜菜碱的浓度为0.01～0.1M，所述述甜菜碱溶液中假病毒的浓度为10ng/mL～40ng/mL。
[0035]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测新型冠状病毒RNA的组合物，其特征在于，所述组合物包含通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对和通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒N基因的引物对，其中，所述通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒ORF1ab基因的引物对的序列为：ORF1ab基因上游引物序列：5'
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cacttaaaaacacagtctgtacc
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3'，ORF1ab基因下游引物序列：5'
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gaacccatgcttcagtcagctga
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3'；所述通过聚合酶链式反应扩增新型冠状病毒N基因的引物对的序列为：N基因上游引物序列：5'
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gctagaatggctggcaat
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3'，N基因下游引物序列：5'
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gcttgagagcaaaatgtc
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3'。2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含通过聚合酶链式反应检测新型冠状病毒ORF1ab基因和/或新型冠状病毒N基因的探针，其中，所述检测新型冠状病毒ORF1ab基因的探针的序列为：5'
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gtggaaaggttatggctgtagttgtgatc
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3'；所述检测新型冠状病毒N基因的探针的序列为：5'
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gatgctgctcttgctttgctgctgcttgac
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3'。3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述ORF1ab基因的探针的5'末端标记FAM荧光基团，3'末端标记TAMRA淬灭基团；所述N基因的探针的5'末端标记VIC荧光基团，3'末端标记TAMRA淬灭基团。4.如权利要求1～3任意一项中所述的组合物在制备检测或筛查样本中的新型冠状病毒RNA的产品中的用途，其中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：王海滨，高智强，杨晓涵，彭闯，周其玲，窦瑞艳，王奇，唐洁，张公安，石风，王维，
申请(专利权)人：北京纳捷诊断试剂有限公司，
类型：发明
国别省市：