一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合及方法技术

本发明专利技术公开了一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合及方法。该多重PCR引物探针组合的具体序列如SEQ ID NO.1～12所示。本发明专利技术提供的基于该组引物和试剂盒的检测方法具有操作简单、灵敏度高、特异性强、检测速度快的优点，能够同时检测对虾WSSV、IHHNV、EHP和NHP这四种病原菌，大大节约检测时间。间。间。

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合及方法


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合及方法和用途。

技术介绍

[0002]白斑综合征是由白斑综合征病毒WSSV引起的一种疫病，该病被世界动物卫生组织(OIE)要求强制通报。发病急、死亡率高，死亡速度快是该病的明显特点，WSSV在自然环境中的传播形式主要有垂直和水平两种途径。二十多年来该病一直是全球对虾养殖产业的主要威胁。WSSV的宿主范围非常宽泛，迄今为止已经确定了WSD的98个潜在宿主物种。
[0003]传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV于1981年首次在美国夏威夷地区的细角滨对虾中发现，随后在美洲和亚洲多个国家发现。宿主种类多如：细角滨对虾、凡纳滨对虾、罗氏沼虾等，对幼虾的的危害较大。虽然IHHNV不引起南美白对虾的死亡，但是会造成南美白对虾头胸甲、触角等畸形并且生长缓慢，其临床症状被称为慢性矮小残缺综合症。
[0004]虾肝肠胞虫EHP是2009年发现的微孢子虫新种，严格细胞内寄生，亚太地区多数国家的养殖对虾中均有发现。对虾感染该寄生虫后，会导致对虾出现生长缓慢或生长停滞，有时会出现白便等症状，但其不影响对虾的摄食和存活率。目前认为EHP是影响对虾生长缓慢的最主要的病原，成为对虾养殖的最大威胁之一，严重影响了对虾养殖业的产量增长，造成了严重的经济损失。这种疾病在对虾的仔虾期直至养成期均有感染的迹象，并且该疾病有大规模爆发的趋势
[0005]对虾肝胰腺坏死病NHP是由一种类立克次体的细菌肝胰腺坏死性细菌(Necrotizing hepato pancreatitis bacterium，NHPB)引起的对虾疾病。NHPB是一种革兰氏阴性菌，多形态，专性细胞内寄生。NHPB是一种感染能力很强的菌种，宿主包括南美白对虾、白滨对虾、细角滨对虾等。病原的传播方式主要是水平传播—通过污染的水体、食物等。
[0006]目前，对虾病害种类较多，诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法、分子杂交及PCR技术。已建立的常规PCR技术，常是一次只能检测一种病原，比较费时间。而多重PCR技术是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病原特异性引物，能够同时检测多种病原体，从而缩短病原检测的周期，提高检测效率。但多重PCR检测也受多种因素的影响，比如DNA聚合酶的活性、模板的质量、所设计的病原引物的特异性、PCR反应条件、不同病原样本间对试剂的竞争等因素都会影响检测结果的敏感性和准确性。
[0007]基于当前现状，需建立一种准确、快速、简便的对虾病原检测方法，以利于对病原的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。

技术实现思路

[0008]针对现有技术中的上述不足，本专利技术提供一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合及方法和用途，本专利技术目的在于提供一种方便快捷，检测限低，且特
异性强、灵敏度高、准确率高、且能同时检测对虾白斑综合征病毒、对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒、虾肝肠胞虫、对虾肝胰腺坏死病等四种病原菌的多重荧光PCR检测方法。
[0009]为实现上述目的，本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0010]一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合，该多重PCR引物组合所包括的引物和探针序列如下：
[0011]WSSV
‑
F：5
’‑
TGGTCCCGTCCTCATCTCAG
‑3’
；(SEQ ID NO.1)
[0012]WSSV
‑
R：5
’‑
GCTGCCTTGCCGGAAATTA
‑3’
；(SEQ ID NO.2)
[0013]WSSV
‑
探针：5
’‑
AGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACA
‑3’
；(SEQ ID NO.3)
[0014]IHHNV
‑
F：5
’‑
TACTCCGGACACCCAACCA
‑3’
；(SEQ ID NO.4)
[0015]IHHNV
‑
R：5
’‑
GGCTCTGGCAGCAAAGGTAA
‑3’
；(SEQ ID NO.5)
[0016]IHHNV
‑
探针：5
’‑
ACCAGACATAGAGCTACAATCCTCGCCTATTTG
‑3’
；(SEQ ID NO.6)
[0017]EHP
‑
F：5
’‑
AGTAAACTATGCCGACAA
‑3’
；(SEQ ID NO.7)
[0018]EHP
‑
R：5
’‑
AATTAAGCAGCACAATCC
‑3’
；(SEQ ID NO.8)
[0019]EHP
‑
探针：5
’‑
TCCTGGTAGTGTCCTTCCGT
‑3’
；(SEQ ID NO.9)
[0020]NHP
‑
F：5
’‑
CGTTCACGGGCCTTGTACAC
‑3’
；(SEQ ID NO.10)
[0021]NHP
‑
R：5
’‑
GCTCATCGCCTTAAAGAAAAGATAA
‑3’
；(SEQ ID NO.11)
[0022]NHP
‑
探针：5
’‑
CCGCCCGTCAAGCCATGGAA
‑3’
。(SEQ ID NO.12)
[0023]本专利技术用于检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的引物组包括：WSSV的VP664基因、IHHNV的非结构蛋白2(non
‑
structural protein 2)基因、EHP的小亚基核糖体RNA(small subunit ribosomal RNA)基因、NHP的16SrRNA基因所对应的特异性引物探针序列组；引物和探针的特异性强、灵敏度高，可应用荧光PCR方法同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP。
[0024]进一步地，在探针的3
’
端连接有淬灭基团，并在不同探针的5
’
端连接有不同的荧光基团。
[0025]进一步地，淬灭基团为BHQ1或BHQ2；所述荧光基团为CY5、VIC、Texas Red或6
‑
FAM。
[0026]一种试剂盒，包括上述多重PCR引物探针组合。
[0027]本专利技术用于检本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种同时检测WSSV、IHHNV、EHP和NHP的多重PCR引物探针组合，其特征在于，所述多重PCR引物组合所包括的引物序列如下：WSSV
‑
F：5
’‑
TGGTCCCGTCCTCATCTCAG
‑3’
；WSSV
‑
R：5
’‑
GCTGCCTTGCCGGAAATTA
‑3’
；WSSV
‑
探针：5
’‑
AGCCATGAAGAATGCCGTCTATCACACA
‑3’
；IHHNV
‑
F：5
’‑
TACTCCGGACACCCAACCA
‑3’
；IHHNV
‑
R：5
’‑
GGCTCTGGCAGCAAAGGTAA
‑3’
；IHHNV
‑
探针：5
’‑
ACCAGACATAGAGCTACAATCCTCGCCTATTTG
‑3’
；EHP
‑
F：5
’‑
AGTAAACTATGCCGACAA
‑3’
；EHP
‑
R：5
’‑
AATTAAGCAGCACAATCC
‑3’
；EHP
‑
探针：5
’‑
TCCTGGTAGTGTCCTTCCGT
‑3’
；NHP
‑
F：5
’‑
CGTTCACGGGCCTTGTACAC
‑3’
；NHP
‑
R：5
’‑
GCTCATCGCCTTAAAGAAAAGATAA
‑3’
；NHP
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：安微，徐国锋，张婧，郑晶，林华，杨苗，谢礼，
申请(专利权)人：西南医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：