【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子检测，具体涉及一种检测鲍曼不动杆菌的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、颅内感染是一种感染性疾病，全球患病率和致死率较高。根据chinet的相关数据，鲍曼不动杆菌是在脑脊液检出率高达第二位。因此及时发现鲍曼不动杆菌感染对患者治疗以及预后来说是十分有必要的。而现在对鲍曼不动杆菌的诊断主要还是依靠传统的细菌培养，生化鉴定以及质谱技术。传统细菌培养和生化鉴定所需时间较长，灵敏度低，不适用于即时诊断；也需要在传统细菌培养的基础之上才能进行；而质谱技术检测限为105cfu/ml,且准确率低于90％，仪器昂贵，不适于基层医院的检测，也不适用于鲍曼不动杆菌的早期筛查。而通过pcr扩增16srna基因的限制性内切酶分析对实验室环境以及操作者的专业水平都有很高的限制与要求，因此这种也不适用基层医院以及大面积爆发鲍曼不动杆菌的筛查。
2、国内也有关于鲍曼不动杆菌的检测试剂盒。胡韦维等人利用鲍曼不动杆菌的特异性引物探针lfd-mira来对鲍曼不动杆菌进行快速检测，检测下限为6cfu/ml，但是这种方式方法需要先进行核酸提取，不适用于一些基层医疗机构。其次，杨波等人通过鲍曼不动杆菌抗原elisa测定试剂盒来对鲍曼不动杆菌进行检测。此试剂盒主要包括包被抗鲍曼不动杆菌fhue及pilf蛋白多克隆抗体的酶标板、抗鲍曼不动杆菌ompa及pona蛋白多克隆抗体、鲍曼不动杆菌阳性对照、阴性对照、洗涤液、酶标二抗、酶显色底物和终止液。反应复杂，酶和抗体的价格昂贵，所以需要有新的检测试剂盒来对以上的缺陷进行优化。
3、因此研究
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种基于核酶步行者电化学dna传感器方法检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，所述试剂盒包括如下核酸：
2、核苷酸序列如seq id no.1所示的aptarner、核苷酸序列如seq id no.2所示的trigger、核苷酸序列如seq id no.3所示的substrate、核苷酸序列如seq id no.4所示的dnazyme、核苷酸序列如seq id no.5～8所示的locking。
3、进一步地，所述locking的核苷酸序列如seq id no.7所示。
4、进一步地，所述试剂盒还包括如下试剂：1×te/mg2+缓冲液、封闭核酶、mg2+溶液和tris-hcl；
5、所述1×te/mg2+缓冲液的ph值为8.0，成分组成为：40mm tris–hcl、1mm edta、12.5mm mgcl2和100mm nacl，其余为水。
6、本专利技术还提供了一种前述试剂盒在制备用于检测鲍曼不动杆菌的装置中的用途，所述装置为基于核酶步行者的电化学dna传感器。
7、本专利技术最后提供了一种用于检测鲍曼不动杆菌的电化学dna传感器，所述传感器按照如下步骤制备：
8、1)制备固定有substrate链的金电极
9、取substrate链滴加在活化的金电极表面，静置1～3h，清洗后加6-巯基-1-己醇孵育，即得；
10、2)制备电化学dna传感器
11、取dnazyme-locking复合链滴加到步骤1)所得金电极上孵育，得工作电极，将工作电极与参比电极、辅助电极和电解质组合，即得；
12、3)制备用于鲍曼不动杆菌检测的电化学dna传感器
13、取待测样品溶液、apt-t复合链和tris-hcl混合，混合液与封闭核酶和mg2+溶液于缓冲液中反应，反应后的溶液加到步骤2)所得电化学dna传感器的工作电极上反应，反应完全清洗后，置入步骤2)所得电化学dna传感器的电解质中，即得能用于检测的电化学dna传感器；
14、所述substrate链是substrate与三(2-羧乙基)膦盐酸盐和tris-hcl溶液混合而成；
15、所述dnazyme-locking复合链是dnazyme和locking在1×te/mg2+缓冲液中复合而成；
16、所述apt-t复合链是aptarner和trigger在1×te/mg2+缓冲液中复合而成。
17、进一步地，步骤1)所述substrate链的浓度为0.5～2.5μm，优选1.5μm；所述金电极表面滴加10μl substrate链；所述6-巯基-1-己醇与substrate链的体积比为1：1；所述孵育是室温避光孵育30～120min，优选60min。
18、更进一步地，1.5μm substrate链是10μm substrate与10mm三(2-羧乙基)膦盐酸盐和tris-hcl溶液按体积比8：5：40在黑暗中混合静置30min而成。
19、进一步地，步骤2)所述金电极表面滴加10μl dnazyme-locking；所述dnazyme-locking复合链的浓度为0.05-2μm，优选为0.1μm；所述孵育20～60min，优选40min；所述参比电极为ag/agcl电极：辅助电极为铂丝；所述电解质为tris-hcl溶液。
20、更进一步地，浓度0.1μm dnazyme-locking复合链是10μm的dnazyme和10μmlocking与1×te/mg2+缓冲液按体积比5:5:450混合，95℃孵育10分钟而得。
21、进一步地，步骤3)所述待测样品溶液、apt-t复合链、tris-hcl的体积比为25：5：20；所述apt-t复合链的浓度为0.5～5μm，优选1μm。
22、更进一步地，浓度0.1μm apt-t复合链是10μm的aptarner和10μmtrigger与1×te/mg2+缓冲液按体积比5:5:40混合，95℃孵育10分钟而得。
23、进一步地，步骤3)所述混合的温度为37℃，转速300rpm，时间45min；所述混合液、封闭核酶、mg2+溶液和缓冲液的体积比为10:2:1:37；在所述缓冲液中反应30分钟；所述缓冲液为tris-hcl溶液，mg2+溶液的浓度为10μm，封闭核酶的浓度为1μm；所述工作电极上滴加10μl反应后的溶液，黑暗条件下再反应40分钟。
24、进一步地，所述清洗是用含0.05％tween的tris-hcl清洗。
25、进一步地，所述待测样品溶液包括脑脊液，优选人脑脊液。
26、相对现有技术，本专利技术的有益效果为：
27、(1)依赖于分子识别元件--适配体来捕获鲍曼不动杆菌，适配体的序列是针对鲍曼不动杆菌的特性来设计的，能将鲍曼不动杆菌同其他的杂质区分开，特异性强；
28、(2)在dnazyme的作用下，可以得到可视化的电化学信号，易于判读；
29、(3)传感器中涉及到的各种dna序列通过设计，可以使trigger链在反应中循环利用，增大输出信号，使该方法可以检测到临床本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于核酶步行者电化学DNA传感器方法检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下核酸：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述Locking的核苷酸序列如SEQ IDNO.7所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下试剂：1×TE/Mg2+缓冲液、封闭核酶、Mg2+溶液和Tris-Hcl；
4.权利要求1～3任一项所述试剂盒在制备用于检测鲍曼不动杆菌的装置中的用途，其特征在于：所述装置为基于核酶步行者的电化学DNA传感器。
5.一种用于检测鲍曼不动杆菌的电化学DNA传感器，其特征在于：按照如下步骤制备：
6.根据权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于：步骤1)所述Substrate链的浓度为0.5～2.5μM，优选1.5μM；所述金电极表面滴加10μLSubstrate链；所述6-巯基-1-己醇与Substrate链的体积比为1：1；所述孵育是室温避光孵育30～120min，优选60min。
7.根据权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于：步
8.根据权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于：步骤3)所述待测样品溶液、Apt-T复合链、Tris-Hcl的体积比为25：5：20；所述Apt-T复合链的浓度为0.5～5μM，优选1μM；所述混合的温度为37℃，转速300rpm，时间45min；所述混合液、封闭核酶、Mg2+溶液和缓冲液的体积比为10:2:1:37；在所述缓冲液中反应30分钟；所述缓冲液为Tris-Hcl溶液；所述工作电极上滴加10μL反应后的溶液，黑暗条件下再反应40分钟。
9.根据权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于：所述清洗是用含0.05％Tween的Tris-Hcl清洗。
10.根据权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于：所述待测样品溶液包括脑脊液，优选人脑脊液。
...【技术特征摘要】
1.一种基于核酶步行者电化学dna传感器方法检测鲍曼不动杆菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括如下核酸：
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述locking的核苷酸序列如seq idno.7所示。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括如下试剂：1×te/mg2+缓冲液、封闭核酶、mg2+溶液和tris-hcl；
4.权利要求1～3任一项所述试剂盒在制备用于检测鲍曼不动杆菌的装置中的用途，其特征在于：所述装置为基于核酶步行者的电化学dna传感器。
5.一种用于检测鲍曼不动杆菌的电化学dna传感器，其特征在于：按照如下步骤制备：
6.根据权利要求5所述的电化学传感器，其特征在于：步骤1)所述substrate链的浓度为0.5～2.5μm，优选1.5μm；所述金电极表面滴加10μlsubstrate链；所述6-巯基-1-己醇与substrate链的体积比为1：1；所述孵育是室温避光孵育30～120min，优选60min。
7.根据权利要求5所述的电化学传感器，其...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘靳波，徐学静，谢静玲，李宝林，姜慧，
申请(专利权)人：西南医科大学附属医院，
类型：发明
国别省市：
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