SARS-CoV-2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法技术

本发明专利技术提供了一种SARS

【技术实现步骤摘要】
SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法


[0001]本专利技术属于体外诊断试剂
，具体地说，本专利技术涉及SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒核酸等温多重检测试剂及检测方法。

技术介绍

[0002]等温扩增技术弥补了PCR需要变温温控仪器设备的不足，等温温控设备可以更加小型化、便携化，因此更适合于即时诊断(POCT)。等温扩增技术在医学检验、畜牧水产、宠物医疗中均具有应用。
[0003]一般地，等温扩增技术主要依靠链置换DNA聚合酶，以LAMP等温扩增为例，其主要依靠Bst链置换DNA聚合酶，该酶除了具有互补ssDNA的聚合活性，同时也具有强烈的链置换能力，即在延伸的时候将dsDNA中的另一条链完整的置换下来，这也使得该技术不需要循环的变温过程，即在同一个温度下(60
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65℃)即可短时间内(30
‑
60分钟)完成10
11
倍的靶标扩增。
[0004]等温扩增可使用非特异性荧光染料(如SYBR Green)对产物进行实时荧光检测。此外，等温扩增还可以和多种指示剂兼容，实现可视化检测，比如金属指示剂羟基萘酚蓝(HNB)可随着反应过程中镁离子浓度的变化发生变色反应。
[0005]不过，目前的等温扩增仍有大量的非特异性扩增，存在假阳性的可能，并且难以实现多重检测。
[0006]基于CRISPR基因编辑酶的检测技术作为目前最为热点的检测技术，其解决了现有技术中的多种问题，比如实现等温扩增的多重性、高特异性，同时也为免扩增检测技术等提供了可能。不过CRISPR也具有自身的一些不足，比如PAM/PFS序列限制、gRNA合成成本高、多重检测体系复杂(一种酶仅对应单重靶标)等。
[0007]本专利技术涉及的基因编辑酶Argonaute(Ago)蛋白可依赖5'
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磷酸化修饰的gDNA或gRNA完成对ssDNA或RNA的靶向顺式剪切。经研究发现，一些源自极端环境中的耐高温古菌Ago，可在高温(95℃)下，完成对dsDNA解链的两条ssDNA的靶向剪切。这种以gDNA指导的特异性DNA靶向剪切能力在体外诊断当中，特别是多重靶向检测中，相比于Cas蛋白无选择的反式剪切具有更大的应用潜力。
[0008]SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒是目前全球流行的呼吸道传染病病原，这三种病毒感染引起的症状十分相似，但治疗方案与防控措施有所不同，因此可用于快速区分鉴别的多重核酸检测技术十分重要。
[0009]然而，目前尚缺乏令人满意的，高效灵敏地同时检测SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒三种病毒的多重检测试剂和检测方法。

技术实现思路

[0010]本专利技术的目的在于提供高效灵敏地同时检测SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流
感病毒三种病毒的多重检测试剂和检测方法。
[0011]在本专利技术的第一方面，提供了一种SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂包括向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：
[0012](Z1)针对SARS
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CoV
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2的第一gDNA对：
[0013]其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；
[0014]P
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TTGATGAGGTTCCACC SEQ ID No:19
[0015]P
‑
TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:20
[0016](Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：
[0017]其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和
[0018]P
‑
TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:21
[0019]P
‑
TGTCACCTCTGACTAA SEQ ID No:22
[0020](Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：
[0021]其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示:
[0022]P
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TATTTTATTGCCTCAA SEQ ID No:23
[0023]P
‑
TAGGTGTGGTGCGCAA SEQ ID No:24。
[0024]在另一优选例中，所述多重检测试剂还包括荧光报告核酸集，所述荧光报告核酸集包括：
[0025](Y1)针对SARS
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CoV
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2的第一荧光报告核酸：
[0026]其中，第一荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:25所示；
[0027](Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸：
[0028]其中，荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:26所示；和
[0029](Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸：
[0030]其中，第三荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:27所示。
[0031]在另一优选例中，第一荧光报告核酸、第二荧光报告核酸和第三荧光报告核酸的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。
[0032]在另一优选例中，所述的荧光基团选自下组：FAM、ROX、VIC、HEX、Cy5、Cy3、TAMRA、NED、JOE、TET。
[0033]在另一优选例中，所述的淬灭基团选自下组：BHQ1、BHQ2、TAMRA。
[0034]在另一优选例中，所述探针SARS
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CoV
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2 Reporter的5'端标记有报告荧光染料FAM，3'端标记有淬灭基团BHQ1；所述探针Influenza A Reporter的5'端标记有报告荧光染料ROX，3'端标记有淬灭基团BHQ2；所述探针Influenza B Reporter的5'端标记有报告荧光染料VIC，3'端标记有淬灭基团BHQ1。
[0035]在另一优选例中，所述多重检测试剂还包括LAMP引物组的集，所述LAMP引物组的集包括：
[0036](W1)针对SARS
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CoV
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2的第一LAMP引物组：
[0037]其中，第一LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:1～6所示的6种引物；(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组：
[0038]其中，LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:7～12所示的6种引物；和
[003本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂包括向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：(Z1)针对SARS
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CoV
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2的第一gDNA对：其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；P
‑
TTGATGAGGTTCCACC SEQ ID No:19P
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TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:20(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和P
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TCAGTTGTGGCATCTC SEQ ID No:21P
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TGTCACCTCTGACTAA SEQ ID No:22(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示:P
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TATTTTATTGCCTCAA SEQ ID No:23P
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TAGGTGTGGTGCGCAA SEQ ID No:24。2.如权利要求1所述的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂还包括荧光报告核酸集，所述荧光报告核酸集包括：(Y1)针对SARS
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CoV
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2的第一荧光报告核酸：其中，第一荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:25所示；(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸：其中，荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:26所示；和(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸：其中，第三荧光报告核酸的序列如SEQ ID No:27所示。3.如权利要求2所述的荧光报告核酸集，其特征在于，第一荧光报告核酸、第二荧光报告核酸和第三荧光报告核酸的一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。4.如权利要求1所述的核酸等温多重检测试剂，其特征在于，所述多重检测试剂还包括LAMP引物组的集，所述LAMP引物组的集包括：(W1)针对SARS
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CoV
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2的第一LAMP引物组：其中，第一LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:1～6所示的6种引物；(W2)针对甲型流感病毒的第二LAMP引物组：其中，LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:7～12所示的6种引物；和(W3)针对乙型流感病毒的第三LAMP引物组：其中，第三LAMP引物组的序列包括分别如SEQ ID No:13～18所示的6种引物。5.一种用于检测SARS
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CoV
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2、甲型流感病毒和乙型流感病毒的核酸的反应体系，其特征在于，所述的反应体系含有：(Z)用于检测核酸的向导ssDNA(gDNA)集(set)，所述gDNA集包括：(Z1)针对SARS
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CoV
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2的第一gDNA对：其中，第一gDNA对的序列分别如SEQ ID No:19和20所示；(Z2)针对甲型流感病毒的第二gDNA对：其中，第二gDNA对的序列分别如SEQ ID No:21和22所示；和
(Z3)针对乙型流感病毒的第三gDNA对：其中，第三gDNA对的序列分别如SEQ ID No:23和24所示；(Y)用于产生检测信号的荧光报告核酸集，所述荧光报告核酸集包括：(Y1)针对SARS
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CoV
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2的第一荧光报告核酸；(Y2)针对甲型流感病毒的第二荧光报告核酸；和(Y3)针对乙型流感病毒的第三荧光报告核酸；其中，第一、第二、和第三荧光报告核酸产生不同的可检测信号；(W)用于等温扩增SARS
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CoV
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2、甲型流感...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯雁，叶星宇，刘倩，李忠磊，胡语歆，孙君卫，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：