一种检测甘薯病毒H的qRT-PCR试剂盒制造技术

本发明专利技术属于植物病原生物病毒分子检测技术领域，提供了一种检测甘薯病毒H的特异性引物组，正向和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:2

【技术实现步骤摘要】
一种检测甘薯病毒H的qRT
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PCR试剂盒


[0001]本专利技术属于植物病原生物病毒分子检测
，具体涉及到利用逆转录荧光定量聚合酶链式反应扩增技术检测甘薯病毒H的引物及方法。

技术介绍

[0002]甘薯[Ipomocabatatas(L.) Lam]属于旋花科甘薯属植物，现在在世界上100多个国家和地区作为被广泛种植。在我国甘薯俗称番薯、红薯、山芋等，是一种重要的粮食作物，加工作物，也可以用作保健食品、蔬菜和园艺园艺。目前我国是世界上最大的甘薯种植国，其产量占世界产量的一半以上。
[0003]甘薯病毒H（SweetpotatovirusH，SPVH）是我国在2023年通过small RNA测序和PCR扩增获得的一种新的属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒，能够引起甘薯叶片花叶斑驳等症状。SPVH引起的症状特点与其他侵染甘薯的马铃薯Y病毒属病毒（甘薯羽状斑驳病毒、甘薯病毒C、甘薯病毒G等马铃薯Y病毒属病毒）无明显差别，单独侵染引起的症状比较轻微，严重时会出现类似羽状斑驳的症状。该病毒基因组结构也与这些侵染甘薯的Potyvirus病毒相似，说明其也可能具有能与SPCSV协生能力，可导致更加严重病害如植株矮缩畸形等SPVD病害症状。
[0004]目前调查发现SPVH在我国其他地区也有发生，但是缺少病毒检测的技术，因此对我国甘薯病毒H整体发生发展情况并不清楚。而甘薯的无性繁殖种植模式，也方便病毒通过种薯种苗进行长距离扩散。目前早期预警并及早铲除病毒苗，茎尖脱毒技术以及防治传毒介体是防治病毒病的主要手段，因此，开发病毒检测技术加强对甘薯病毒H的监测，进行早期诊断预警，对指导甘薯脱毒具有重要意义。

技术实现思路

[0005]针对现有技术中缺乏检测甘薯病毒H（SPVH）的问题，本专利技术提供一种检测甘薯病毒H的qRT
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PCR的试剂盒，检测限低、特异性好。
[0006]为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。
[0007]一种用于甘薯病毒H检测的靶标基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0008]一种检测甘薯病毒H的特异性引物组，正向和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 2
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3，SEQ ID NO: 4
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5，SEQ ID NO: 6
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7所示。
[0009]一种包含上述特异性引物组的检测甘薯病毒H的试剂盒。
[0010]所述试剂盒还包括进行逆转录荧光定量聚合酶链式反应（qRT
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PCR）的试剂，如阳性分子、荧光染料、DNA聚合酶、逆转录酶、底物、缓冲液等。
[0011]具体地，试剂包括：5
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HiScript II Select qRTSuperMix、ddH2O、SYBR Green荧光定量扩增预混液、标准阳性质粒模板。上述试剂可以通过商业购买或本领域公知的方法进行制备或配制。
[0012]一种检测甘薯病毒H的方法，其包括以下步骤：
（1）提取待测样品的总RNA；（2）以步骤（1）提取的RNA为模板，以如SEQIDNO:3、SEQIDNO:5或SEQIDNO:7所示的序列为引物逆转录获得cDNA；（3）以步骤（2）中获得的cDNA为模板，以如SEQIDNO:2
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3，SEQIDNO:4
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5或SEQIDNO:6
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7所示的序列分别为正、反向引物进行荧光定量PCR扩增；（4）当CT值≤35且出现典型的扩增曲线，则结果为阳性；当CT值>35、无CT值或无扩增曲线，结果为阴性。
[0013]本专利技术具有以下优点：甘薯病毒H作为甘薯上的新发病毒，对其的分子检测，尚无报道。本专利技术针通过对甘薯马铃薯病毒属病毒全基因组序列比对，找到甘薯病毒H基因组与其他甘薯病毒基因组差异区域，设计了甘薯病毒HqRT
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PCR引物对。该特异性引物对甘薯病毒H特异性好，对甘薯褪绿矮化病毒、甘薯褪绿斑点病毒、甘薯潜隐病毒、甘薯病毒2、甘薯病毒C、甘薯羽状斑驳病毒、甘薯病毒G、黄瓜花叶病毒等其他侵染甘薯的病毒无扩增曲线，检测准确、高效灵敏，可以实现对大田薯苗、种薯种苗以及组培苗中甘薯病毒H带毒情况进行诊断以及早期预警。
附图说明
[0014]图1为不同引物组扩增溶解曲线图；图2为不同引物组扩增CT值柱形图；图3为不同反应温度的qRT
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PCR扩增CT值折线图；图4为不同引物浓度qRT
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PCR扩增CT值柱形图；图5为不同甘薯病毒qRT
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PCR扩增曲线；图6为甘薯病毒HqRT
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PCR标准曲线；图7为SPVHqRT
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PCR扩增曲线；图8为SPVHPCR灵敏度检测，其中，M：DL2000DNAMarker。
具体实施方式
[0015]下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。
[0016]实施例1甘薯病毒HqRT
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PCR扩增引物设计、筛选1.引物设计根据甘薯病毒H与其他侵染甘薯的马铃薯Y病毒属病毒的基因组序列进行比对分析，选择序列如SEQIDNo:1所示的区域作为靶标序列；设计3对引物组合进行qRT
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PCR扩增。其中，所述引物组具体序列如表1所示。
[0017]表1甘薯病毒HqRT
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PCR扩增引物组
2.样品RNA的提取和反转录取甘薯病毒H的阳性病样0.1g用液氮研磨成粉状，利用FastPureUniversalPlantTotalRNAIsolationKit对RNA进行提取，将提取出的RNA取6μL加入5
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HiScriptIISelectqRTSuperMix4μL，分别加入浓度为10μmol/L反向引物SPVH
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R1、SPVH
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R2、SPVH
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R3各1μL，置于3个PCR管中，ddH2O补足至20μL，50℃15min，85℃5s获得cDNA。
[0018]3.qRT
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PCR扩增反应反应总体系为20μL，首先在0.2mL的荧光定量PCR管中加入荧光定量混合液ChamQUniversalSYBRqPCRMasterMix10μL，ddH2O8.2μL，分别加入10μmol/L的SPVH正、反向引物SPVH
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F1、SPVH
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R1，SPVH
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F2、SPVH
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R2和SPVH
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F3、SPVH
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R3各0.4μL，分别加入cDNA模板1μL，用移液器吸打混匀；将配置好的反应体系放置到荧光定量PCR仪ABIQuantStudio
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6Flex，参本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于甘薯病毒H检测的靶标基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。2.一种检测甘薯病毒H的特异性引物组，其特征在于，正向和反向引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO: 2
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3，SEQ ID NO: 4
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5，SEQ ID NO: 6
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7所示。3.一种包含如权利要求2所述的特异性引物组的检测甘薯病毒H的试剂盒。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括进行逆转录荧光定量聚合酶链式反应的试剂，所述试剂选自阳性分子、荧光染料、DNA聚合酶、逆转录酶、底物、缓冲液中的一种或几种。5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括：5
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HiScript II Select qRTS...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐伟，陈晶伟，孙厚俊，张成玲，杨冬静，马居奎，高方园，
申请(专利权)人：江苏徐淮地区徐州农业科学研究所江苏徐州甘薯研究中心，
类型：发明
国别省市：