一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物及检测方法技术

本发明专利技术公开了一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物及检测方法。本发明专利技术针对海洋蓝细菌肌尾噬菌体的T4

【技术实现步骤摘要】
一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物及检测方法


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物及检测方法。

技术介绍

[0002]病毒是海水中丰度最高的生物粒子，具有重要的生态学意义。蓝细菌肌尾噬菌体(cyanomyovirus)是海洋中重要的病毒类群，它们侵染的宿主是蓝细菌。由于蓝细菌是海洋中主要的初级生产者，在寡营养海域其对初级生产力的贡献可达50％，蓝细菌噬菌体侵染并裂解宿主具有重要的碳循环贡献，具有重要的生态意义。蓝细菌肌尾噬菌体包括T4
‑
like、TIM5
‑
like等类群，但T4
‑
like类群是目前发现的主要类群。流式细胞法与荧光显微镜镜检法是检测水体样本中病毒粒子丰度的主要方法，但是这两种方法检测的是总病毒丰度，不能检测特定的病毒类群。实时荧光定量PCR(real time polymerase chain reaction，qPCR)法是检测特定病毒类群的主要方法。目前，蓝细菌肌尾噬菌体的定量方法主要是基于g20基因的实时荧光定量PCR检测。然而，目前使用的g20基因的引物会引起非特异性扩增，高估了蓝细菌肌尾噬菌体的量，造成定量不准确。

技术实现思路

[0003]为了解决上述蓝细菌肌尾噬菌体引物的设计问题，更好的进行蓝细菌肌尾噬菌体准确定量，本专利技术提供了一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物。
[0004]本专利技术针对蓝细菌肌尾噬菌体的核糖核苷酸还原酶(ribonucleotide reductase)Alpha亚基基因(nrdA)，基于nrdA基因设计特异性引物将可实现对该类群噬菌体的qPCR检测。海洋蓝细菌肌尾噬菌体的多样高，因此覆盖面广、特异性强是引物设计的重要考量因素，因此须设计具有一定简并性的引物，对于我们准确定量蓝细菌肌尾噬菌体的丰度具有特别重要的意义。本专利技术中的检测引物设计具有简并性，所覆盖的海洋蓝细菌肌尾噬菌体的多样性较高，通过该引物应用于实时荧光定量PCR检测，旨在促进分子生物学技术在海洋蓝细菌肌尾噬菌体检测中的应用，解决蓝细菌肌尾噬菌体丰度的准确定量问题。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：
[0006]本专利技术设计一对能够特异性扩增海洋蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物nrdA
‑
F和nrdA
‑
R，可以用于海洋环境中蓝细菌肌尾噬菌体T4
‑
like类群总丰度的定量。本专利技术中的检测引物是针对海洋蓝细菌肌尾噬菌体T4
‑
like分支的核糖核苷酸还原酶Alpha亚基基因(nrdA)序列而设计的特异性引物，命名为nrdA
‑
F/nrdA
‑
R，其中nrdA
‑
F(正向引物序列)为5
’‑
GATGACACCCTCGATAGYAT
‑3’
(如SEQ ID NO.1所示)，nrdA
‑
R(反向引物序列)为5
’‑
TGWGTRCARCATCKGACAGT
‑3’
(如SEQ ID NO.2所示)。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测试剂盒，包括上述的检测引物nrdA
‑
F/nrdA
‑
R。
[0008]本专利技术的第三个目的是提供一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测方法，包括以下步骤：
提取待测样品的DNA作为模板，利用上述的检测引物nrdA
‑
F/nrdA
‑
R进行qPCR，反应结束后，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有蓝细菌肌尾噬菌体。
[0009]优选，所述的根据扩增曲线判断待测样品中是否含有蓝细菌肌尾噬菌体的标准为：如果扩增曲线有典型扩增曲线，则说明待测样品中含有蓝细菌肌尾噬菌体，如果扩增曲线无典型扩增曲线，则说明待测样品中不含有蓝细菌肌尾噬菌体。
[0010]优选，所述的qPCR，其qPCR体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L检测引物nrdA
‑
F和nrdA
‑
R各1.0μL、Green Pro Taq HS Premix 12.5μL、DNA模板1.0μL、无菌水9.5μL；qPCR反应程序为二步法：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火与延伸30s，收集荧光信号，重复45个循环。
[0011]本专利技术的第四个目的是提供一种蓝细菌肌尾噬菌体丰度的定量方法，包括以下步骤：
[0012](1)将以若干不同种蓝细菌肌尾噬菌体的基因组DNA或海洋环境DNA为模板，上述的检测引物nrdA
‑
F/nrdA
‑
R为扩增引物得到的PCR扩增产物分别连接到质粒上，构建得到若干重组质粒，将随机选择的重组质粒等量混合后得到混合重组质粒，然后将混合重组质粒梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，利用上述的检测引物nrdA
‑
F/nrdA
‑
R建立qPCR体系进行qPCR；
[0013](2)反应结束后得到各起始混合重组质粒浓度模板对应的循环数Ct，以混合重组质粒浓度的对数值为横坐标，循环数Ct为纵坐标，建立标准曲线；
[0014](3)提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用检测引物nrdA
‑
F/nrdA
‑
R建立与步骤(1)相同的qPCR体系进行qPCR，反应结束后得到循环数Ct，将其代入标准曲线，计算得到待测样品中蓝细菌肌尾噬菌体的丰度。
[0015]优选，步骤(1)所述的qPCR体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L的权利要求1所述的检测引物nrdA
‑
F和nrdA
‑
R各1.0μL、Green Pro Taq HS Premix 12.5μL、DNA模板1.0μL、无菌水9.5μL。
[0016]优选，步骤(1)和(3)所述的qPCR，其qPCR反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火与延伸30s，收集荧光信号，重复45个循环。
[0017]本专利技术的第五个目的是提供上述的检测引物在检测海洋环境中蓝细菌肌尾噬菌体丰度中的应用。
[0018]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0019]本专利技术中，我们设计得到一对引物，针对海洋蓝细菌肌尾噬菌体的定量检测，可以覆盖海洋中丰度高、分布广泛的蓝细菌肌尾噬菌体T4
‑
like类群，适合海洋环境中蓝细菌肌尾噬菌体的快速准确定量。
附图说明
[0020]图1为引物退火与延伸温度的筛选。
[0021]图2为南海真光层内蓝细菌肌尾噬菌体nrdA基因的丰度。
[0022]图3为基于混合标准子获得的扩增曲线（A）、熔解峰（B）及标准曲线（C）。图4为真光层海水中，随着采样深度增加，蓝细菌肌尾噬菌体的丰度呈现先增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测引物，其特征在于，所述的检测引物如下所示：nrdA
‑
F：5
’‑
GATGACACCCTCGATAGYAT
‑3’
；nrdA
‑
R：5
’‑
TGWGTRCARCATCKGACAGT
‑3’
。2.一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测引物。3.一种蓝细菌肌尾噬菌体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测样品的基因组DNA作为模板，利用权利要求1所述的检测引物nrdA
‑
F/nrdA
‑
R进行qPCR，反应结束后，根据扩增曲线判断待测样品中是否含有蓝细菌肌尾噬菌体。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的根据扩增曲线判断待测样品中是否含有蓝细菌肌尾噬菌体的标准为：如果扩增曲线有典型扩增曲线，则说明待测样品中含有蓝细菌肌尾噬菌体，如果扩增曲线无典型扩增曲线，则说明待测样品中不含有蓝细菌肌尾噬菌体。5.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的qPCR，其qPCR体系为：每25μL包括以下组分：10μmol/L的权利要求1所述的检测引物nrdA
‑
F和nrdA
‑
R各1.0μL、R各1.0μL、Green Pro Taq HS Premix 12.5μL、DNA模板1.0μL、无菌水9.5μL；qPCR反应程序为二步法：95℃预变性30s；95℃变性5s，60℃退火与延伸30s，收集荧光信号，重复45个循环。6.一种海洋蓝细菌肌尾噬菌体丰度的定量方法，其特征在于，包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄思军，张建东，龙丽娟，
申请(专利权)人：中国科学院南海海洋研究所，
类型：发明
国别省市：