同时检测六种瓜类病毒细菌的多重RT-PCR检测试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了同时检测六种瓜类病毒细菌的多重RT

【技术实现步骤摘要】
同时检测六种瓜类病毒细菌的多重RT
‑
PCR检测试剂盒及其检测方法


[0001]本专利技术属于植物检疫
，涉及生物检测技术，具体设计一种用于检测六种瓜类病毒细菌的多重RT
‑
PCR检测试剂盒以及应用该检测试剂盒鉴定六种瓜类病毒细菌检测或者六种瓜类病毒细菌的植物材料的方法。

技术介绍

[0002]葫芦科(Cucurbitaceae)作物包括95个属965种，其中瓜类作物主要包括西瓜、甜瓜等水果和黄瓜、南瓜、葫芦等蔬菜，是生产中非常重要的经济作物。我国是葫芦科作物的生产大国，也是消费大国，据联合国粮食与农业组织(FAO)2019年数据显示，我国葫芦科作物总产量约为1.53亿吨，约占世界总产量的64.02％。葫芦科作物种质可携带30余病毒，每种病毒都可造成严重的经济损失。目前，我国已经发现和鉴定的病毒有烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)、小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus，ZYMV)、西瓜花叶病毒(Watermelon mosaic virus，WMV)、黄瓜绿斑驳花叶病毒(Cucumber green mottle mosaic virus,CGMMV)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)等，这些病毒对瓜类作物可能造成花叶、植株矮小、叶卷缩、叶脉皱缩变形、叶面凹凸不平、顶叶和茎蔓扭曲等症状，严重时茎蔓节间缩短、簇生小叶、结瓜少且小或畸形甚至不结瓜、瓜面上有瘤状突起或环形斑、萎缩死亡等。
[0003]瓜类果斑病菌(嗜酸菌属西瓜种，Acidovorax citrulli，AC)引起的瓜类细菌性果斑病是一种严重的细菌性病害，被美国认为是西瓜上的毁灭性病害；该病害在世界范围内广泛传播，1988年首次在我国报道，在我国超过14个省份的甜瓜、西瓜等瓜类作物上发生，减产46％以上。0.01％污染的种子可引起病害的发生及流行，无症状果实的种子也有可能带菌，一旦感染会对瓜类产量带来巨大经济损失，该病害已成为影响我国葫芦科作物生产的主要病害之一。
[0004]目前常见的瓜类病毒和细菌的检测方法主要有两种，一是以ELISA为主的血清学方法，该办法灵敏度低，假阳性率高。且无法进行多种病原物的同步检测；二是基于核酸扩增的常规PCR方法，由于侵染瓜类作物的病毒种类多，逐一检测操作繁琐、耗时较长且成本较高。多重RT
‑
PCR在病原物检测领域已有一些研究，可以调高检测效率。关于同时检测烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒这五种侵染瓜类作物的主要RNA病毒的方法未见报道，更未见专门的同时检测这五种RNA病毒和瓜类果斑病菌的多重RT
‑
PCR检测试剂盒。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供六种瓜类病毒细菌的多重RT
‑
PCR检测引物组合。
[0006]本专利技术的另一目的是提供含有上述引物组合的用于多重RT
‑
PCR检测六种瓜类病毒细菌的试剂盒。
[0007]本专利技术的再一目的是提供六种瓜类病毒细菌的多重RT
‑
PCR检测方法。
[0008]为了实现本专利技术目的，首先参考Genbank和现有文献中报道的序列，进行比对、筛选和设计多重RT
‑
PCR引物，旨在使选择的引物可以适用于五种瓜类病毒和瓜类果斑病菌，可特异地获得在琼脂糖凝胶电泳清晰、明确地区分开的目标片段。
[0009]本专利技术提供用于鉴定六种瓜类病毒细菌的成套引物对，由特异引物对A、特异引物对B、特异引物对C、特异引物对D、特异引物对E、特异引物对F和特异引物对G组成；
[0010]所述特异引物对A由引物TMV
‑
F和引物TMV
‑
R组成；
[0011]所述特异引物对B由引物ZYMV
‑
F和引物ZYMV
‑
R组成；
[0012]所述特异引物对C由引物WMV
‑
F和引物WMV
‑
R组成；
[0013]所述特异引物对D由引物CGMMV
‑
F和引物CGMMV
‑
R组成；
[0014]所述特异引物对E由引物CMV
‑
F和引物CMV
‑
R组成；
[0015]所述特异引物对F由引物AC
‑
F和引物AC
‑
R组成；
[0016]所述特异引物对G由引物EF1
‑
α
‑
F和引物EF1
‑
α
‑
R组成。
[0017]所述引物TMV
‑
F为如下a1)或a2)：
[0018]a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
[0019]a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
[0020]所述引物TMV
‑
R为如下a3)或a4)：
[0021]a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
[0022]a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
[0023]所述引物ZYMV
‑
F为如下b1)或b2)：
[0024]b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
[0025]b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
[0026]所述引物ZYMV
‑
R为如下b3)或b4)：
[0027]b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；
[0028]b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
[0029]所述引物WMV
‑
F为如下c1)或c2)：
[0030]c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；
[0031]c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
[0032]所述引物WMV
‑
R为如下c3)或c4)：
[0033]c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；
[0034]c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；
[0035]所述引物CGMMV
‑
F为如下d1)或d2)：
[0036]d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；
[0037]d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴定六种瓜类病毒细菌的成套引物对，由特异引物对A、特异引物对B、特异引物对C、特异引物对D、特异引物对E、特异引物对F和特异引物对G组成；所述特异引物对A由引物TMV
‑
F和引物TMV
‑
R组成；所述特异引物对B由引物ZYMV
‑
F和引物ZYMV
‑
R组成；所述特异引物对C由引物WMV
‑
F和引物WMV
‑
R组成；所述特异引物对D由引物CGMMV
‑
F和引物CGMMV
‑
R组成；所述特异引物对E由引物CMV
‑
F和引物CMV
‑
R组成；所述特异引物对F由引物AC
‑
F和引物AC
‑
R组成；所述特异引物对G由引物EF1
‑
α
‑
F和引物EF1
‑
α
‑
R组成。所述引物TMV
‑
F为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物TMV
‑
R为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ZYMV
‑
F为如下b1)或b2)：b1)序列表中序列3所示的单链DNA分子；b2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物ZYMV
‑
R为如下b3)或b4)：b3)序列表中序列4所示的单链DNA分子；b4)将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物WMV
‑
F为如下c1)或c2)：c1)序列表中序列5所示的单链DNA分子；c2)将序列5经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物WMV
‑
R为如下c3)或c4)：c3)序列表中序列6所示的单链DNA分子；c4)将序列6经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物CGMMV
‑
F为如下d1)或d2)：d1)序列表中序列7所示的单链DNA分子；d2)将序列7经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物CGMMV
‑
R为如下d3)或d4)：d3)序列表中序列8所示的单链DNA分子；
d4)将序列8经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物CMV
‑
F为如下e1)或e2)：e1)序列表中序列9所示的单链DNA分子；e2)将序列9经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物CMV
‑
R为如下e3)或e4)：e3)序列表中序列10所示的单链DNA分子；e4)将序列10经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物AC
‑
F为如下f1)或f2)：f1)序列表中序列11所示的单链DNA分子；f2)将序列11经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物AC
‑
R为如下f3)或f4)：f3)序列表中序列12所示的单链DNA分子；f4)将序列12经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述引物EF1
‑
α
‑
F为如下g1)或g2)：g1)序列表中序列13所示的单链DNA分子；g2)将序列13经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物EF1
‑
α
‑
R为如下b3)或b4)：g3)序列表中序列14所示的单链DNA分子；g4)将序列14经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子；所述六种瓜类病毒细菌为烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或瓜类果斑病菌。2.如权利要求1所述的成套引物对，其特征在于：所述引物TMV
‑
F、所述引物TMV
‑
R、所述引物ZYMV
‑
F、所述引物ZYMV
‑
R、所述引物WMV
‑
F、所述引物WMV
‑
R、所述引物CGMMV
‑
F、所述引物CGMMV
‑
R、所述引物CMV
‑
F、所述引物CMV
‑
R、所述引物AC
‑
F、所述引物AC
‑
R、所述引物EF1
‑
α
‑
F和所述引物EF1
‑
α
‑
R的摩尔比为2:2:2:2:1:1:4:4:2:2:2:2:4:4。3.权利要求1或2所述的成套引物对在如下h1)
‑
h8)中任一所述的应用：h1)制备用于鉴定六种瓜类病毒细菌的产品；h2)鉴定六种瓜类病毒细菌；h3)制备用于鉴定待测病原物是否为六种瓜类病毒细菌的产品；h4)鉴定待测病原物是否为六种瓜类病毒细菌；h5)制备用于鉴别六种瓜类病毒细菌的产品；
h6)鉴别六种瓜类病毒细菌；h7)制备用于检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌的产品；h8)检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌；所述六种瓜类病毒细菌为烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或瓜类果斑病菌。4.含有权利要求1或2所述成套引物对的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下i1)
‑
i4)中任一种：i1)鉴定六种瓜类病毒细菌中的至少一种；i2)鉴定待测病毒是否为六种瓜类病毒细菌；i3)鉴别六种瓜类病毒细菌；i4)检测待测样品中是否含有六种瓜类病毒细菌；所述六种瓜类病毒细菌为烟草花叶病毒、小西葫芦黄花叶病毒、西瓜花叶病毒、黄瓜绿斑驳花叶病毒、黄瓜花叶病毒和/或瓜类果斑病菌。5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下(Ⅰ)或(Ⅱ)的步骤：(Ⅰ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物分别单独包装；(Ⅱ)权利要求1或2所述的成套引物对中各引物对的各条引物按比例混合在一起。6.一种鉴定待测病毒是否为六种瓜类病毒细菌的方法，包括如下步骤：以待测病原物的RNA为模板，采用权利要求1或2所述的成套引物对进行RT
‑
PCR扩增，得到RT
‑
PCR扩增产物；若所述RT

【专利技术属性】
技术研发人员：张永江，赵振兴，向均，田茜，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，
类型：发明
国别省市：