一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物及方法。本发明专利技术的引物是针对呼吸道合胞病毒A型和B型的G蛋白基因的特异性引物。利用本发明专利技术的引物检测结果特异性好，与除呼吸道合胞病毒A型和B型之外的其他可感染穿山甲的病毒没有交叉反应；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为10

【技术实现步骤摘要】
一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物及方法


[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物及方法。

技术介绍

[0002]呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus，RSV)是肺炎病毒科正肺病毒属成员，属于单负链病毒目，是人类急性呼吸道感染的重要病原体，临床表现从轻微的急性上呼吸道感染或中耳炎到严重的潜在危及生命的下呼吸道感染。
[0003]RSV病毒属于非节段性单股负链RNA病毒。RSV病毒基因组全长约15.2 Kb，包含10个基因，编码11种蛋白，包括8种结构蛋白（F、G、M2
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1、M2
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2、SH、N、P、L）和3种非结构蛋白（NS1、NS2、NS3)；其中融合蛋白（fusion protein，F）和粘附蛋白（attachment protein，G）是两个主要的包膜糖蛋白。根据F蛋白和G蛋白的突变，RSV病毒分为A和B两种亚型。
[0004]RSV首先是从黑猩猩中分离出来的。该病毒可以通过实验感染小鼠、大鼠、棉鼠、雪貂和仓鼠，但不会在这些动物种群中自然传播。而近年来发现马来亚穿山甲(Manis javanica)自然感染了RSV，这些RSV与人类流行的菌株具有99.4%
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99.8%的基因组同一性。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是为穿山甲RSV
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A和RSV
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B检测提供了一种特异、敏感、快速、简便、可定量检测穿山甲RSV
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A和RSV
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B的荧光定量PCR引物及方法，是一种SYBR Green染料法荧光定量方法，可快速特异地检测RSV
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A和RSV
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B。
[0006]本专利技术的第一目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物，包括上游引物RSV
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A/B
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G
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F和下游引物RSV
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A/B
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G
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R，所述的上游引物RSV
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A/B
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G
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物RSV
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A/B
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G
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R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0007]本专利技术的第二个目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR试剂盒，包括所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物和SYBR Green染料法荧光定量PCR试剂。
[0008]优选，所述的试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述的阳性对照品为含有呼吸道合胞病毒A型和呼吸道合胞病毒B型共同保守的G基因片段的重组质粒，所述的阴性对照品为无酶ddH2O。
[0009]本专利技术的第三个目的是提供一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR方法，包括以下步骤：S1. 提取待检样品的RNA并反转录为cDNA；S2. 利用所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物和SYBR Green染料法荧光定量PCR试剂，以步骤S1获得的cDNA为模板进行荧光定量PCR扩增；
S3. 反应结束后，根据扩增曲线情况判断待检样品中是否含有呼吸道合胞病毒A型或B型；所述的判断的方法为：如果扩增曲线为典型荧光扩增曲线，则待检样品中含有呼吸道合胞病毒A型和/或B型；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则待检样品中不含有穿山甲呼吸道合胞病毒A型或B型。
[0010]本专利技术具有以下有益效果：本专利技术的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂含有用于检测RSV
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A和RSV
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B的一对特异性引物。本专利技术的试剂盒检测结果特异性好，RSV
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A和RSV
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B可同时检测，且扩增曲线良好，其他可感染穿山甲的相关病原均未出现特异性扩增曲线；敏感性高，检测10倍梯度稀释的阳性标准品，检出限度为101copies/μL；检测快速简便，解决了现有RSV
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A和RSV
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B的检测方法耗时费力、特异性敏感性差、成本高等的问题，对于确定穿山甲是否感染RSV
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A和RSV
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B具有重要意义。
附图说明
[0011]图1为RSV
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A和RSV
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B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法的扩增曲线。图中：1代表RSV
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B的扩增曲线；2代表RSV
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A的扩增曲线；3代表阴性对照（无酶ddH2O）的扩增曲线。
[0012]图2为RSV
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A和RSV
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B的SYBR Green染料法荧光定量PCR检测方法特异性检测，图中：1代表RSV
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B的扩增曲线；2代表RSV
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A的扩增曲线；3代表东阳病毒（Dong yang pangolin virus，DYPV）基因组的扩增曲线、4代表副流感病毒5型（PIV5）基因组的扩增曲线、5代表丽水穿山甲病毒（Lishui pangolin virus，LSPV）基因组的扩增曲线、6代表巴泰病毒（Batai virus，BATV）基因组的扩增曲线、7代表盖塔病毒（Getah virus，GETV）基因组的扩增曲线及8代表阴性的扩增曲线。
[0013]图3为用荧光定量法检测RSV
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A病毒灵敏性；图上标示的数字5
‑
1表示RSV
‑
A病毒模板依次分别为3.05
×
105copies/μL到3.05
×
101copies/μL 10倍系列稀释阳性标准品的扩增曲线，图上标示的数字0、阴性对照对应为3.05
×
100copies/μL阳性标准品、阴性对照的扩增曲线。
[0014]图4为用荧光定量法检测RSV
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B病毒灵敏性；图上标示的数字5
‑
1表示RSV
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B病毒模板依次分别为1.82
×
105copies/μL到1.82
×
101copies/μL 10倍系列稀释阳性标准品的扩增曲线，图上标示的数字0、阴性对照对应为1.82
×
100copies/μL阳性标准品、阴性对照的扩增曲线。
具体实施方式
[0015]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0016]实施例11.针对G基因保守区设计特异性引物和探针从GenBank上下载穿山甲RSV
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物，其特征在于，包括上游引物RSV
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A/B
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G
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F和下游引物RSV
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A/B
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G
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R，所述的上游引物RSV
‑
A/B
‑
G
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F的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的下游引物RSV
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A/B
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G
‑
R的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。2. 一种检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的检测穿山甲呼吸道合胞病毒A型和B型的荧光定量PCR引物和SYBR Green染料法...

【专利技术属性】
技术研发人员：华彦，刘昊，张洁玲，胡锦，任振宇，燕洪美，邝英杰，吴文斌，
申请(专利权)人：广东省林业科学研究院，
类型：发明
国别省市：