一种将测序微球固定在基因测序芯片内表面的方法技术

本专利公开一种将测序微球固定在基因测序芯片内表面的方法，可以实现高通量测序芯片的可重复利用。通过半导体光刻、深反应离子刻蚀的方法，加工深宽比(>1)的测序芯片微坑，将粒径大于芯片微坑开口的测序微球，通过收缩剂控制测序微球的收缩率，通过离心或是磁性微球碾压的方式，卡入测序微坑后并溶胀，以完成微球在微坑内的固定。在测序结束后，通过特定有机相和水相清洗液，使测序微球收缩解离出坑，或通过裂解试剂，裂解测序微球并清洗，以实现测序芯片回收再利用的目的。测序芯片回收再利用的目的。测序芯片回收再利用的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种将测序微球固定在基因测序芯片内表面的方法


[0001]本专利技术涉及一种将测序微球固定在基因测序芯片内表面的方法，属于基因测序


技术介绍

[0002]在高通量测序中，经常利用微球作为待测核酸分子的载体，并将微球固定在基因测序芯片表面的微坑或微阱内，进而完成测序反应。现有技术中将测序微球固定在芯片微坑内通常是借助于二者表面特定的化学修饰基团之间的相互作用实现的，这就要求在微米尺度甚至纳米尺度的微坑内表面进行精准的化学修饰，同时在测序微球表面也要进行对应的化学修饰，例如，常见的，在微球表面修饰生物素，在微坑内表面修饰链霉亲和素，利用生物素和链霉亲和素之间的相互作用将微球固定在微坑内。这种方法的缺陷是显而易见的，一方面，对微坑的化学修饰增加了芯片的制作难度和制作成本；另一方面，降低了微球的载量，微球表面的修饰位点不能完全用于负载待测核酸分子，有一部分位点要用于与微坑表面的修饰基团反应。因此，需要开发一种更加简单的、不依赖于微球和微坑修饰基团的反应而将测序微球固定在芯片内表面的方法。

技术实现思路

[0003]本专利技术公开一种将测序微球固定在基因测序芯片内表面的方法，其特征在于，包括：
[0004]1)提供基因测序芯片，所述基因测序芯片的内表面有预先加工好的微坑；
[0005]2)将测序微球分散到第一溶液中，形成测序微球悬浮液，再将所述测序微球悬浮液通入芯片流动池，使测序微球进入芯片内表面的微坑中；所述第一溶液中包含使得微球处于收缩状态的组分；所述测序微球为水凝胶微球，或者非刚性微球；
[0006]3)用第二溶液置换所述第一溶液，使测序微球体积增大，并卡在所述微坑中，使得微球加载固定到微坑中；所述测序微球在第二溶液中比在第一溶液中具备更大的体积；
[0007]4)除去未加载固定的微球。
[0008]根据优选的实施方式，所述微坑的直径为0.25
‑
5微米，优选0.3
‑
3.5微米，更优选0.5
‑
3微米。
[0009]根据优选的实施方式，所述微坑的深度大于宽度，即深宽比大于1，优选为1.1
‑
1.5。
[0010]根据优选的实施方式，所述微坑的纵截面为矩形或类矩形，即从上到下的宽度相同或近似相同。
[0011]根据优选的实施方式，所述测序微球为水凝胶微球，其直径比微坑直径大10％
‑
25％，所述测序微球悬浮液中的测序微球的最终直径，大于微坑的开口尺寸，比微坑直径大1％
‑
10％，优选大5％
‑
10％。
[0012]根据优选的实施方式，所述第一溶液包括甲醇、乙醇、异丙醇、金属复合物、碱或碱
土金属盐、非离子聚合物或去离子水与前面任意一项或者多项的组合。
[0013]根据优选的实施方式，步骤2)进一步包括在测序微球悬浮液中加入磁性微球，所述磁性微球的直径大于微坑直径，将所述磁性微球和测序微球溶液充分混匀后，在外加磁场的作用下，通过磁性微球将测序微球碾压进微坑中。
[0014]根据优选的实施方式，所述磁性微球的数量少于测序微球的数目，二者比例为1/2
‑
1/10。
[0015]根据优选的实施方式，所述磁性微球是顺磁性磁珠。
[0016]根据优选的实施方式，所述第二溶液包括超纯水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris
‑
盐酸缓冲液、常规测序缓冲液中的一种，用所述第二溶液缓慢置换所述第一溶液，静置反应，使测序微球体积增大，直到测序微球恢复其收缩前的直径，从而使测序微球卡在微坑内固定。
[0017]根据优选的实施方式，所述测序微球表面修饰有特定化学基团，用于直接连接待测核酸或者通过连接扩增引物间接地将待测核酸固定到测序微球表面；所述化学基团包括生物素，链霉亲和素，羧基，氨基，硅羟基，叠氮基团，炔基，环氧乙基等。
[0018]本专利技术的第二方面公开一种可重复使用的基因测序方法，其特征在于，包括：
[0019](1)提供基因测序芯片，所述基因测序芯片的内表面有预先加工好的微坑；
[0020](2)将测序微球分散到第一溶液中，形成测序微球悬浮液，再将所述测序微球悬浮液通入芯片流动池，使测序微球进入芯片内表面的微坑中；所述第一溶液中包含使得微球处于收缩状态的组分；所述测序微球为水凝胶微球，或者非刚性微球；
[0021](3)用第二溶液置换所述第一溶液，使测序微球体积增大，并卡在所述微坑中，使得微球加载固定到微坑中；所述测序微球在第二溶液中比在第一溶液中具备更大的体积；
[0022](4)提供测序反应物，进行测序；
[0023](5)去除测序微球；
[0024](6)重复步骤(2)
‑
(4)。
[0025]根据优选的实施方式，当进行多次测序反应时，所述步骤(6)变为重复步骤(2)
‑
(5)。
[0026]根据优选的实施方式，在步骤(3)和步骤(4)之间还包括对待测基因片段进行扩增。
[0027]根据优选的实施方式，所述微坑的深宽比大于1，优选在1.1
‑
1.5。
[0028]根据优选的实施方式，所述微坑的纵截面为矩形或类矩形，即从上到下的宽度相同或近似相同。
[0029]根据优选的实施方式，所述测序微球为水凝胶微球，其直径比微坑直径大10％
‑
25％，所述测序微球悬浮液中的测序微球的最终直径，大于微坑的开口尺寸，比微坑直径大1％
‑
10％，优选大5％
‑
10％。
[0030]根据优选的实施方式，所述第一溶液包括甲醇、乙醇、异丙醇、金属复合物、碱或碱土金属盐、非离子聚合物或去离子水与前面任意一项或者多项的组合。
[0031]根据优选的实施方式，步骤(2)将测序微球进入基因测序芯片内表面的微坑中，可以通过离心芯片实现。
[0032]根据优选的实施方式，步骤(2)进一步包括在测序微球悬浮液中加入磁性微球，所
述磁性微球的直径大于微坑直径，将所述磁性微球和测序微球溶液充分混匀后，在外加磁场的作用下，通过磁性微球将测序微球碾压进微坑中。
[0033]根据优选的实施方式，所述磁性微球的数量少于测序微球的数目，二者比例为1/2
‑
1/10。
[0034]根据优选的实施方式，所述磁性微球是顺磁性磁珠。
[0035]根据优选的实施方式，所述第二溶液包括超纯水、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris
‑
盐酸缓冲液、常规测序缓冲液中的一种，用所述第二溶液缓慢置换所述第一溶液，静置反应，使测序微球体积增大，直到测序微球恢复其收缩前的直径，从而使测序微球卡在微坑内固定。
[0036]根据优选的实施方式，步骤(4)的测序反应之前还包括将未固定在微坑内的微球去除。
[0037本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种将测序微球固定在基因测序芯片内表面的方法，其特征在于，包括：1)提供基因测序芯片，所述基因测序芯片的内表面有预先加工好的微坑；2)将测序微球分散到第一溶液中，形成测序微球悬浮液，再将所述测序微球悬浮液通入芯片流动池，使测序微球进入芯片内表面的微坑中；所述第一溶液中包含使得微球处于收缩状态的组分；所述测序微球为水凝胶微球，或者非刚性微球；3)用第二溶液置换所述第一溶液，使测序微球体积增大，并卡在所述微坑中，使得微球加载固定到微坑中；所述测序微球在第二溶液中比在第一溶液中具备更大的体积；4)除去未加载固定的微球。2.一种可重复使用的基因测序方法，其特征在于，包括：(1)提供基因测序芯片，所述基因测序芯片的内表面有预先加工好的微坑；(2)将测序微球分散到第一溶液中，形成测序微球悬浮液，再将所述测序微球悬浮液通入芯片流动池，使测序微球进入芯片内表面的微坑中；所述第一溶液中包含使得微球处于收缩状态的组分；所述测序微球为水凝胶微球，或者非刚性微球；(3)用第二溶液置换所述第一溶液，使测序微球体积增大，并卡在所述微坑中，使得微球加载固定到微坑中；所述测序微球在第二溶液中比在第一溶液中具备更大的体积；(4)提供测序反应物，进行测序；(5)去除测序微球；(6)重复步骤(2)
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(4)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述微坑的深度大于宽度，即深宽比大于1。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述测序微球为水凝胶微球，其直径比微坑直径大10％
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25％，所述测序微球悬浮液中的测序微球的最终直径，大于微坑的开口尺寸，比微坑直径大1％
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10％，优选大5％
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10％。5.根据权利要求1或2所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋豫京，乔朔，杜灵国，石磊，陈子天，
申请(专利权)人：赛纳生物科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：