基于探针杂交的高通量转录谱测序文库构建方法技术

本发明专利技术涉及生物医药领域。具体而言，本发明专利技术涉及一种基于探针杂交的高通量转录谱测序文库构建方法，其可用于高通量、低成本地进行药物的筛选。药物的筛选。

【技术实现步骤摘要】
基于探针杂交的高通量转录谱测序文库构建方法


[0001]本专利技术涉及生物医药领域。具体而言，本专利技术涉及一种基于探针杂交的高通量转录 谱测序文库构建方法，其可用于高通量、低成本地进行药物的筛选。
[0002]专利技术背景
[0003]当前新药物的发现很大程度上依赖于高通量筛选，但当前的筛选平台的筛选能力有 限。RNA
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seq是使用转录组变化作为标志物研究药物效应的强大工具，但标准文库构建 成本高昂。Hindrek Teder等人(npj Genomic Medicine(2018)3:34)开发了TAC
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seq技术 用于特定核酸生物标志物的精确定量。然而，TAC
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seq技术需要对每个样品单独用试剂 盒或者Trizol提取RNA，其探针杂交和连接步骤需要分开进行，单一条码(barcode)也限 制了能筛选的样品数量。因此，本领域仍需要改进的高通量转录谱测序文库构建方法。
[0004]附图简述
[0005]图1.基于探针杂交的高通量转录谱测序技术的开发流程和原理图。(A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于探针杂交的高通量转录谱测序文库构建方法，所述方法包括：(a)提供在至少一个多孔板中的至少一种包含细胞的生物学样品，所述至少一种包含细胞的生物学样品的每种分别位于单独的孔中；(b)在所述多孔板的孔中裂解所述生物学样品中的细胞；(c)将步骤(b)获得的细胞裂解上清液转移至另一多孔板的相应孔中，进行逆转录反应以获得cDNA；(d)向每个孔添加杂交
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连接混合液，所述混合液包含DNA连接酶以及至少一组与至少一个待检测基因的靶区域特异性杂交的探针对，其中所述探针对包括与所述靶区域的上游部分杂交的左探针和与所述靶区域的下游部分杂交的右探针；(e)使所述至少一组探针对杂交至所述至少一个待检测基因的靶区域，并且使杂交至所述靶区域上的所述探针对中的左探针和右探针相互连接；(f)富集所述连接产物；(g)向每个孔添加条码化(Barcoding)PCR混合液，所述混合液包含DNA聚合酶以及条码(Barcode)引物对，所述条码(Barcode)引物对包含针对所述左探针的第一引物以及针对所述右探针的第二引物，所述第一和第二引物中的一种包含对每个孔而言是唯一的孔条码序列，另一种包含对于每个多孔板而言是唯一的板条码序列；(h)用所述条码引物对通过PCR扩增所述至少一个待检测基因的靶区域；和(i)收获并混合所述至少一个多孔板的至少一个孔中的扩增产物，并任选地纯化，由此获得可用于高通量转录谱测序的文库。2.权利要求1的方法，其中所述多孔板是96孔板或384孔板，优选96孔板。3.权利要求1或2的方法，其中所述至少一种包含细胞的生物学样品为1
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200种或更多种，例如至少2种，至少5种、至少10种、至少20种、至少30种、至少40种、至少50种、至少100种、至少150种、至少200种或更多种包含细胞的生物学样品。4.权利要求1
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3中任一项的方法，其中所述至少一种包含细胞的生物学样品是各自包含不同的细胞类型的生物学样品。5.权利要求1
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3中任一项的方法，其中所述至少一种包含细胞的生物学样品包含相同的细胞类型的生物学样品，但每种生物学样品都经过不同的处理，例如经过不同化合物的处理。6.权利要求5的方法，其中所述处理能够导致细胞的特定表型。7.权利要求1
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6中任一项的方法，其中所述细胞是体细胞、生殖细胞或干细胞(如胚胎干细胞或诱导的多能干细胞)。8.权利要求1
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6中任一项的方法，其中所述细胞选自神经元细胞、骨骼肌细胞、肝细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、间质细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、神经细胞、造血细胞、胰岛细胞或肿瘤细胞。9.权利要求1
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8中任一项的方法，其中所述细胞来源于哺乳动物或非哺乳动物，例如，所述细胞来源于人、小鼠、大鼠或非人灵长类动物。10.权利要求1
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9中任一项的方法，其中步骤(b)中使用基于非离子型表面活性剂的细胞裂解液裂解所述细胞，优选地，所述非离子型表面活性剂是Triton X
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100。11.权利要求10的方法，其中所述细胞裂解液由Tris
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HCl、KCl、聚蔗糖如Ficoll PM
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400、Triton X
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100、核糖核酸酶抑制剂和水组成。12.权利要求10的方法，其中所述细胞裂解液各组分的使用终浓度是：大约5mM至大约500mM Tris
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HCl、大约7.5mM至大约750mM KCl、大约0.6％至大约60％聚蔗糖如Ficoll PM
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400、大约0.015％至大约1.5％Triton X
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100、大约0.05U/μL至大约5U/μL核糖核酸酶抑制剂。13.权利要求1
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12中任一项的方法，其中所述步骤(c)中的逆转录反应在大约40
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45℃例如42℃下进行；和/或，所述逆转录反应进行大约15
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60分钟，例如大约30分钟。14.权利要求1
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13中任一项的方法，其中所述步骤(d)中的DNA连接酶选自T4 DNA连接酶或Taq DNA连接酶，优选Taq DNA连接酶。15.权利要求1
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14中任一项的方法，其中所述杂交
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连接混合液包含1
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200个或更多个，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个或更多个探针对。16.权利要求15的方法，其中所述探针对用于检测1
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200个或更多个，例如至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少100个、至少150个、至少200个或更多个待检测基因。17.权利要求1
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16中任一项的方法，其中所述待检测基因与所述细胞的至少一种表型相关。18.权利要求17的方法，其中所述至少一个待检测基因的部分或全部的表达谱用作所述表型的标记物。19.权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，李军，赵扬，
申请(专利权)人：南京昕瑞再生医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：