适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用技术

本发明专利技术公开了适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用。本发明专利技术对于混合血痕的DNA提取提出新策略，结合现有的PCR技术、通用的毛细管电泳平台基础，能实现一部分混合血斑的分离。本发明专利技术的检测成本低、操作简单、易于推广，有益于在法医学实验室推广应用。本发明专利技术为法医学混合血斑提供一种新的分离技术，使分离混合血斑成为可能，能为法庭科学的个体识别提供有力支持。力支持。力支持。

【技术实现步骤摘要】
适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种混合血斑处理方法，具体涉及一种适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用。属于法医遗传学应用


技术介绍

[0002]法庭科学检案中，混合检材多由受害人与施暴者的个体成分混合而成。混合斑占了大概总检材量的近十分之一，识别其中不同成分来源才能为法庭科学提供可靠的证据。
[0003]性侵案中，男性精子/女性阴道液是最多见的混合斑。Gill等年提出差异裂解法(different extraction),也称两步消化法(two
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step lysis)。由于精子细胞膜表面有大量的硫醇蛋白(cross
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linkedthiol
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richproteins)，其中含有大量的二硫键，这让精子细胞相比于上皮细胞更难裂解，利用精子的这种特性，在处理精液与其他成分混合的样本时，先以常规的DNA提取方法除去精子以外的细胞成分，通过离心留下精子细胞从而获得其DNA。随着差异提取法在全球性推广应用，并伴随着其他精子分离方法的开发应用，大量的性侵案得以告破。
[0004]检案中，混合血斑的出现频率仅次于男女混合斑，常常被发现在现场衣物、床单等棉织物上。然而由于混合血斑细胞类型相同，细胞核结构上无差异，所以无法通过目前的差异提取法(二步提取法)分离混合成分。对于混合血斑，一般是采用常规的DNA提取方法得到混合DNA，之后对混合图谱基因型进行判定。实际检案中，法医物证混合斑的检测多采用常染色体短串联重复序列(short tandem repeats，STRs)遗传标记。当采用常染色体遗传标记检测一名个体时，一个基因座最多可出现2条信号峰，而如果是二名个体混合斑，则可分别出现1条，2条，3条或4条信号峰。为了推导混合成分可能的基因型组合(Genotype combinations)，首先必须对其中混合比(Mixed gradient)进行评估。混合斑一般由主要成分(Major component)和次要成分(Minor component)组成。当主要成分/次要成分接近及大于3/1时，混合成分的基因型将相对容易识别，此时，法医学常定义该类混合斑为可识别混合斑(Resolvedmixed stains)。当混合成分比接近时(1/1至2/1)时,同一基因座各信号峰强度将趋于相似，此时形成不可识别混合斑(Unresolvedmixed stains)，即可能基因型组合较多，无法明确具体基因型组合(如表1)。不可识别混合斑基因型判定的准确性(Locus separation accuracy)下降，个体识别能力低下。所以对混合血斑，应用现有技术不能分离得到单一成分DNA，同时在混合比相近的情况下，难以推导到明确、特定的基因型。
[0005]表1.混合比相似混合斑出现4条、3条及2条信号峰时可能的基因型
[0006][0007]备注：三条峰时，假定a是相对高峰(即二个等位基因重叠)；二条峰时，假定a是相对高峰(即三个等位基因重叠)。混合比相似的混合血斑可出现多种基因型组合，难以判断特定的基因型组合。
[0008]长期以来，混合检材的成分分离一直被认为是法医案件中的主要挑战。在过去的几十年中，相关研究及方法不断出新，以识别混合斑中的个体来源，尤其是混合成分相同的混合血斑，多年来一直是法医学有待解决的问题。法医学混合血斑目前无法通过现有DNA提取方法来达到分离混合成分的问题。

技术实现思路

[0009]本专利技术的目的是为克服上述现有技术的不足，提供一种适用于混合血斑的DNA分层提取方法及其应用，通过逐步消化混合斑的三个层面，达到分离混合成分的目的，为法医学混合血斑的个体来源识别提供了一种有效方案。
[0010]为实现上述目的，本专利技术采用下述技术方案：
[0011]适用于混合血斑的DNA分层提取方法，具体步骤如下：
[0012](1)固定血痕：将钢针插入混合血斑中，以钢针为中心，剪下一块圆形血痕；
[0013](2)三步分离法提取DNA：从血痕中提取上层细胞DNA，去除中层细胞DNA，提取下层细胞DNA；
[0014](3)分别将上层细胞DNA和下层细胞DNA利用常染色体试剂盒进行扩增，得扩增产物；
[0015](4)对扩增产物进行毛细管电泳分析和基因分析。
[0016]作为优选的技术方案之一，步骤(1)中，钢针短于1.5mL离心管，血痕直径为4mm。
[0017]作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，上层细胞DNA的提取方法如下：先将血痕转移至离心管内，加入双蒸水完全浸没血痕，静置浸泡，轻轻捏住钢针取出血痕，吸出浸泡液，然后向离心管中加入Chelex100，加热孵育，将上层液体轻轻转移到另一离心管中，水浴加热，离心取上清，即得上层细胞DNA的提取液。
[0018]作为进一步优选的技术方案之一，在提取上层细胞DNA时，静置浸泡时间为5～10分钟；加热孵育的工艺条件为：56℃孵育20分钟；水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。
[0019]作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，中层细胞DNA的去除方法如下：将提取上层细胞DNA后的血痕置于离心管中，加入双蒸水完全浸没血痕，加热消化，去除固定用的钢针，离心弃上清即可。
[0020]作为进一步优选的技术方案之一，加热消化的工艺条件为：56℃消化40分钟；离心
的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。
[0021]作为优选的技术方案之一，步骤(2)中，下层细胞DNA的提取方法如下：剪碎置于离心管中的血痕，加入双蒸水完全浸泡血痕，加热消化，加入Chelex100，水浴加热，振荡后离心，取上清，即得下层细胞DNA的提取液。
[0022]作为进一步优选的技术方案之一，加热消化的工艺条件为：56℃孵育60分钟左右。水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。
[0023]作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，利用常染色体试剂盒进行扩增2次，以防止扩增不平衡导致基因型判定受干扰。
[0024]作为优选的技术方案之一，步骤(3)中，具体扩增体系参照试剂盒说明书，PCR反应的循环参数为：96℃，1min；94℃，10sec，60℃，1min，72℃，30sec 30循环；60℃终延伸20min。
[0025]作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，将扩增产物与分子量内标、Hi
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Di甲酰胺混合后，95℃变性3分钟，之后冰浴冷却，进行毛细管电泳分析。
[0026]作为优选的技术方案之一，步骤(4)中，应用Genemapper分析软件进行基因分析。
[0027]上述DNA分层提取方法在混合血斑个体来源识别中的应用。
[0028]本专利技术的有益效果：
[0029]为了解决现有DNA提取方法无法分离混合血斑的难题，本专利技术首本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.适用于混合血斑的DNA分层提取方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)固定血痕：将钢针插入混合血斑中，以钢针为中心，剪下一块圆形血痕；(2)三步分离法提取DNA：从血痕中提取上层细胞DNA，去除中层细胞DNA，提取下层细胞DNA；(3)分别将上层细胞DNA和下层细胞DNA利用常染色体试剂盒进行扩增，得扩增产物；(4)对扩增产物进行毛细管电泳分析和基因分析。2.根据权利要求1所述的DNA分层提取方法，其特征在于，步骤(1)中，钢针短于1.5mL离心管，血痕大小为4mm
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4mm。3.根据权利要求1所述的DNA分层提取方法，其特征在于，步骤(2)中，上层细胞DNA的提取方法如下：先将血痕转移至离心管内，加入双蒸水完全浸没血痕，静置浸泡，轻轻捏住钢针取出血痕，吸出浸泡液，然后向离心管中加入Chelex100，加热孵育，将上层液体轻轻转移到另一离心管中，水浴加热，离心取上清，即得上层细胞DNA的提取液。4.根据权利要求3所述的DNA分层提取方法，其特征在于，在提取上层细胞DNA时，静置浸泡时间为5～10分钟；加热孵育的工艺条件为：56℃孵育20分钟；水浴加热的工艺条件为：98℃水浴10分钟；离心的工艺条件为：13000rpm离心3分钟。5.根据权利要求1所述的DNA分层提取方法，其特征在于，步骤(2)中，中层细胞DNA的去除方法如下：将提取上层细胞DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄健，蔡金洪，郝伟琪，
申请(专利权)人：湖南省脑科医院湖南省第二人民医院，
类型：发明
国别省市：