一种纳米核酸探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了本发明专利技术提供了一种可有效、快速、实时进行多种肿瘤标志物筛查的纳米核酸探针，由DNA四面体、检测单链DNA和辅助单链DNA组成；所述DNA四面体由4条单链DNA经碱基互补配对形成，检测单链DNA带有荧光基团和荧光淬灭基团，且检测单链DNA和辅助单链DNA分别与DNA四面体的两条不同单链通过碱基互补配对连接。本发明专利技术纳米核酸探针检测灵敏度高，生物安全性好，可自身自转运进入细胞，无需其他载体，适用于对活体细胞胞内靶点进行检测，可用于动物活体成像，实现对肿瘤的实时荧光标记。实现对肿瘤的实时荧光标记。实现对肿瘤的实时荧光标记。

【技术实现步骤摘要】
一种纳米核酸探针及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物检测
，具体涉及一种纳米核酸探针及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]诊断肿瘤的传统方法有病理组织活检，核磁共振成像，电子计算机断层扫描等技术，但是这些技术都很难在肿瘤早期对其进行有效的检测与筛查。随着对肿瘤疾病研究的不断深入，肿瘤标志物检测在肿瘤早期检测和筛查中展现出重要意义。肿瘤标志物主要包括蛋白质类、糖类、酶类、激素类物质和一些分化紊乱的基因片段等，是由肿瘤细胞本身合成、释放，或是机体对肿瘤细胞反应而产生或升高的一类物质，存在于血液、细胞、组织或体液中，反映肿瘤的存在和生长，通过化学、免疫学以及基因组学等方法测定肿瘤标志物，对肿瘤的诊断、疗效和复发的监测、预后的判断具有一定的价值。
[0003]核仁素是一种多功能蛋白，主要功能是参与核糖体的生物形成，同时可参与rRNA的加工和mRNA的稳定等多种过程。近年研究发现其在肿瘤发生发展中也发挥着重要作用。核仁素在多种增生活跃的癌症细胞膜上以及细胞质中过表达，恶性肿瘤中高表达的核仁素直接或间接参与信号转导，机制各异，影响肿瘤细胞的存活、增殖、转移并促进肿瘤的进展，可作为肿瘤的生物学标志物。研究发现，核仁素适配子AS1411对核仁素有特异性亲和的能力，AS1441结合核仁素并抑制核仁素表达，诱导肿瘤细胞凋亡。因此，以anti
‑
AS1411为靶DNA进行核仁素检测是肿瘤筛查的一种可行策略。
[0004]现有的肿瘤标志物检测手段主要有定量荧光聚合酶链式反应技术、酶联免疫技术(ELISA)等，但这些手段所针对的检测目标单一且检测时间长，前者仅用于核酸检测，用时需2小时以上，后者仅用于抗原抗体肿瘤标志物检测，用时超过4小时，且无法用于活细胞、活体组织中实现实时直观的肿瘤检测和标记。
[0005]因此，为了提高肿瘤检测筛查的效率和准确率，提供一种新的检测手段，实现肿瘤的实时检测标记，为临床决策提供可靠的依据，具有非常重要的意义。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种可有效、快速、实时进行多种肿瘤标志物筛查的纳米核酸探针。
[0007]本专利技术提供了一种纳米核酸探针，它由如下组分组成：
[0008]DNA四面体、检测单链DNA、辅助单链DNA；
[0009]所述DNA四面体由4条单链DNA经碱基互补配对形成；
[0010]所述检测单链DNA带有荧光基团和荧光淬灭基团；
[0011]所述检测单链DNA和辅助单链DNA分别与DNA四面体的两条不同单链通过碱基互补配对连接；
[0012]进一步地，上述荧光基团为FAM、Cy5、Cy3、ROX、TAMRA中的至少一种，所述淬灭基团
为BHQ1、BHQ2、Dabcyl中的至少一种；优选地，所述荧光基团为Cy5，所述淬灭基团为BHQ2。
[0013]进一步地，上述检测单链DNA形成发卡结构，辅助单链DNA形成发卡结构。
[0014]更进一步地，上述检测单链DNA的荧光基团位于从5
’
端起第11位和第12位核苷酸之间，所述荧光淬灭基团位于从5
’
端起第35位和第36位核苷酸之间；
[0015]所述辅助单链DNA从5
’
端起第1～11位核苷酸与检测单链DNA从5
’
端起第1～11位核苷酸反向互补。
[0016]更进一步地，上述检测单链DNA从3
’
端起第1～11位核苷酸与所述DNA四面体的一条单链从3
’
端起第1～11位核苷酸反向互补配对连接；所述辅助单链DNA从3
’
端起第1～11位核苷酸与所述DNA四面体的另一条单链从3
’
端起第1～11位核苷酸反向互补配对连接。
[0017]更进一步地，上述检测单链DNA从5
’
端至3
’
端的序列如SEQ ID NO.1所示；所述辅助单链DNA从5
’
端至3
’
端的序列如SEQ ID NO.2所示。
[0018]更进一步地，上述DNA四面体是4条单链DNA的序列分别一对一地选自SEQ ID NO.3～6的所述序列。
[0019]更进一步地，上述的纳米核酸探针由如下方法制备而成：
[0020]分别将检测单链DNA、辅助单链DNA、DNA四面体的四条单链DNA的混合物置于足以使DNA变性的温度下维持3～8min，再将温度降低到2～8℃维持20min以上，然后混合，在室温孵育30min以上。
[0021]更进一步地，它由如下方法制备而成：
[0022]分别将检测单链DNA、辅助单链DNA、DNA四面体的四条单链DNA的混合物置于95℃下维持10min，再将温度降低到4℃维持20min以上，然后混合，在室温孵育30min以上。
[0023]本专利技术还提供了上述纳米核酸探针的制备方法，包括如下步骤：
[0024](1)将DNA四面体由4条单链DNA等量溶于TM缓冲液中得溶液a，同时将检测单链DNA溶于TM缓冲液中得溶液b，将辅助单链DNA溶于TM溶液中得溶液c；
[0025](2)溶液a、溶液b、溶液c加热到足以使DNA变性的温度维持3～8min，然后降温到2～8℃维持20min以上；
[0026](3)将溶液a、溶液b、溶液c混合，在室温孵育30min以上。
[0027]本专利技术还提供了上述的纳米核酸探针在基因和/或蛋白的实时荧光检测试剂中的应用。
[0028]进一步地，上述试剂是对肿瘤标志物进行检测和/或标记的试剂。
[0029]本专利技术还提供了上述的纳米核酸探针在活体成像试剂中的应用。
[0030]进一步地，上述试剂是在活细胞或活体组织中成像的试剂。
[0031]本专利技术还提供了一种核酸和/或蛋白的检测或对活细胞中的核酸和/或蛋白靶点进行标记方法，其特征在于，包括将上述的纳米核酸探针与样本在室温下共同孵育5～30min，检测荧光信号强度的步骤。
[0032]进一步地，上述样本为待测核酸和/或蛋白，或为活细胞或活体组织。
[0033]本专利技术的有益效果：本专利技术纳米核酸探针可对多种物质进行检测，包括肿瘤特征蛋白，肿瘤特征基因等；检测时间显著缩短，在数分钟内即可对检测目标进行检出，且可对活细胞和活体组织进行实时直观的荧光检测。
[0034]本专利技术纳米核酸探针与检测目标在室温下进行孵育时，可自发形成杂交链式反
应，形成级联扩增，放大检测信号，检测浓度可低至0.1nM，灵敏度高。
[0035]本专利技术探针可自身自转运进入细胞，无需其他载体，且生物安全性好；因此，适用于对活体细胞胞内靶点进行检测，可用于动物活体成像，实现对肿瘤的实时荧光标记。
[0036]显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种纳米核酸探针，其特征在于，它由DNA四面体、检测单链DNA和辅助单链DNA组成；所述DNA四面体由4条单链DNA经碱基互补配对形成；所述检测单链DNA带有荧光基团和荧光淬灭基团；所述检测单链DNA和辅助单链DNA分别与DNA四面体的两条不同单链通过碱基互补配对连接。2.如权利要求1所述的纳米核酸探针，其特征在于，所述荧光基团为FAM、Cy5、Cy3、ROX、TAMRA中的至少一种，所述淬灭基团为BHQ1、BHQ2、Dabcyl中的至少一种；优选地，所述荧光基团为Cy5，所述淬灭基团为BHQ2。3.如权利要求1所述的纳米核酸探针，其特征在于，所述检测单链DNA形成发卡结构，所述辅助单链DNA形成发卡结构；优选地，所述检测单链DNA的荧光基团位于从5
’
端起第11位和第12位核苷酸之间，所述荧光淬灭基团位于从5
’
端起第35位和第36位核苷酸之间；所述辅助单链DNA从5
’
端起第1～11位核苷酸与检测单链DNA从5
’
端起第1～11位核苷酸反向互补。4.如权利要求3所述的纳米核酸探针，其特征在于，所述检测单链DNA从3
’
端起第1～11位核苷酸与所述DNA四面体的一条单链从3
’
端起第1～11位核苷酸反向互补配对连接；所述辅助单链DNA从3
’
端起第1～11位核苷酸与所述DNA四面体的另一条单链从3
’
端起第1～11位核苷酸反向互补配对连接；优选地，所述检测单链DNA从5
’
端至3
’
端的序列如SEQ ID NO.1所示；所述辅助单链DNA从5
’
端至3
’
端的序列如SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：林云锋，张博文，田陶然，蔡潇潇，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：