一种PolyA检测方法技术

本发明专利技术公开了一种PolyA检测方法，包括以下步骤：在PolyA聚合酶反应体系中对待测靶mRNA进行加尾反应；将加尾后的mRNA加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cDNA；于待测PolyA上游位置设计的特异性正向引物和反向引物对反转录形成的cDNA进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到PolyA尾长。本发明专利技术解决了现有技术中PolyA检测操作过程繁复、准确性不高等缺陷，提供了准确检测不同mRNA PolyA尾长及占比的方法，能够适用模板编码polyT转录PolyA尾长检测，有效定义IVT mRNA的理论PolyA长度的占比。mRNA的理论PolyA长度的占比。mRNA的理论PolyA长度的占比。

【技术实现步骤摘要】
一种PolyA检测方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学
，尤其涉及一种PolyA检测方法。

技术介绍

[0002]细胞信使RNA（mRNA）在真核生物细胞中广泛存在，负责传递遗传信息，指导蛋白质合成。mRNA是一种近来备受关注的基因治疗手段，在肿瘤学、传染病学、蛋白疗法等领域有广泛前景。mRNA的PolyA尾是体外合成mRNA（IVT mRNA）的重要结构元件，通常由两种途径加入：一种由模板编码polyT转录形成；另一种由多聚腺苷酸聚合酶在转录mRNA 3端将腺苷酸催化聚合形成。由于mRNA PolyA尾对IVT mRNA的翻译效率及胞内稳定性起着至关重要的作用，因此PolyA尾长及占比是IVT mRNA的关键工艺质量参数，对mRNA PolyA尾长及占比的有效及准确的表征是非常必要且重要的。
[0003]当前PolyA尾长的检测方法主要为：1）酶切法将PolyA尾通过一定酶切前处理从mRNA中切除并分离后进行液相色谱－质谱联用分析，该方法一方面对PolyA的结构及内部序列有一定限制，例如利用RNase T1酶对mRNA进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种PolyA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：在PolyA聚合酶反应体系中对待测靶mRNA进行加尾反应；步骤2：将加尾后的mRNA加入反转录反应体系，以特异性反转引物进行反转录形成cDNA；步骤3：于待测PolyA上游位置设计的特异性正向引物与反向引物，对反转录形成的cDNA进行聚合酶链式反应得到聚合酶链式反应产物；步骤4：对所述聚合酶链式反应产物进行分离及大小分析，得到PolyA尾长。2.根据权利要求1所述的PolyA检测方法，其特征在于：所述步骤1中，以GTP及ITP的混合溶液作为底物对待测靶mRNA进行加尾反应，使待测靶mRNA在3端加入G/I尾。3.根据权利要求2所述的PolyA检测方法，其特征在于：所述步骤1中，取1μg mRNA加入所述PolyA聚合酶反应体系，所述PolyA聚合酶反应体系包括，在1
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缓冲液下，使用5U PolyA聚合酶，GTP溶液与ITP溶液各为10pmol，于37℃反应60min，得到加尾后mRNA。4.根据权利要求1所述的PolyA检测方法，其特征在于：所述步骤2中，所述特异性反转引物序列如SEQ ID NO .1所示。5.根据权利要求4所述的PolyA检测方法，其特征在于：取5μL加尾后mRNA加入反转录反应体系，所述反转录反应体系包括，在1
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【专利技术属性】
技术研发人员：贾明明，陈立，朱伟萍，
申请(专利权)人：北京立康生命科技有限公司，
类型：发明
国别省市：