使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法技术

本文提供了确定生物样品中分析物位置的方法和包括多个孔的装置，其中多个孔的孔包括包含多个捕获探针的表面。包含多个捕获探针的表面。包含多个捕获探针的表面。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多个孔确定生物样品中分析物位置的方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请根据35U.S.C.
§
119(e)要求于2020年9月16日提交的美国专利申请序列号63/079,153的优先权，该申请的全部内容通过引用纳入本文。

技术介绍

[0003]对象组织内的细胞由于不同细胞内的不同分析物水平(例如，基因和/或蛋白质表达)而在细胞形态和/或功能上存在差异。细胞在组织内的特定位置(例如，细胞相对于邻近细胞的位置或细胞相对于组织微环境的位置)可以影响，例如，细胞的形态、分化、命运、活力、增殖、行为以及与组织中其它细胞的信号转导和串扰。
[0004]空间异质性先前被研究过，所述研究使用的技术仅提供完整组织或部分组织中的少量分析物的数据，或提供单细胞的大量分析物数据，但无法提供有关单细胞在亲本生物样品(例如，组织样品)中位置的信息。
[0005]单一的空间条码化阵列的使用可以确定来自亲本生物样品的单细胞的位置和内容物。样品透化后，细胞的生物内容物自由地流入周边溶液，并可以被动或主动地迁移到下面的空间条码化阵列。然而，阵列的空间分辨率可能受到透化后样品内容物的热力学扩散的限制。主动迁移法(例如，电泳)可以限制但不消除这种扩散。

技术实现思路

[0006]本文提供用于将来自生物样品的细胞定位到空间条码化孔中的方法和手段。细胞可在条码化孔中透化或裂解，从而确保整个细胞的内容物保留在空间条码化孔内用于结合捕获探针(以及后续分析)。在一些示例中，通过将样品压入空间条码化孔的阵列，可以将生物样品分成大约细胞大小的组成部分。
[0007]将细胞及其内容物包含在单个孔中导致更高的捕获效率，因为分析物在与捕获探针的捕获域结合之前不必通过相对大体积的溶液扩散。此外，捕获细胞的转录组导致试验中更高的灵敏度和空间分辨率。使用带有单个捕获探针群的孔为在单张玻片上运行多组学试验提供了可能。将捕获探针固定在孔壁上还可以支持捕获探针的三维空间条码化，实现空间分辨率的第三维。此外，孔的使用模拟了微滴环境。在空间上限制反应的体积(使用本文所述的方法和底物)可以导致反应动力学的速度和效率的提高，同时减少试验试剂的使用。
[0008]本文提供了确定生物样品中分析物位置的方法，其包括：(a)将生物样品的部分置于多个孔中，其中多个孔中的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中多个捕获探针中的一个包含空间条码和捕获域；(b)从生物样品中释放分析物，其中分析物特异性结合捕获探针的捕获域；以及(c)确定(i)对应于分析物或其互补物的序列，以及(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定分析物在生物样品中的位置。在本文所述任何方法的一些实施方式中，基材包含约100万至约500万个孔。
[0009]在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔是平底孔。在本文所述
任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔是圆底孔。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有六边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有七边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有八边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有五边形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有方形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有圆形的周界。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有基本相同的周长。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。
[0010]在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。
[0011]在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。
[0012]在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的一个或多个侧表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，多个捕获探针置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。
[0013]在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(a)中的设置是使用辊或冲压装置施加的压力进行的。在本文所述任何方法的一些实施方式中，使用寡核苷酸光刻将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，使用桥式扩增将多个探针预先连接到孔的表面。在本文所述任何方法的一些实施方式中，通过将多个可溶性水凝胶珠置于孔中将多个捕获探针预先置于孔中，其中多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。
[0014]在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(c)中的释放包括裂解生物样品的部分。本文所述任何方法的一些实施方式中进一步包括，在步骤(c)之前向多个孔中的每个孔加入一种或多种裂解剂。在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(a)中多个孔的每个孔包含一种或多种裂解剂。
[0015]本文所述任何方法的一些实施方式中进一步包括，在步骤(b)之前对生物样品进行固定、染色和成像的一种或多种。在本文所述任何方法的一些实施方式中，生物样品在步
骤(b)之前置于透明基材上。
[0016]在本文所述任何方法的一些实施方式中，生物样品是组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是新鲜、冷冻的组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是固定的组织样品。在本文所述任何方法的一些实施方式中，组织样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。
[0017]在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(d)包括使用特异性结合到捕获域的分析物作为模板延伸捕获探针的末端。在本文所述任何方法的一些实施方式中，步骤(d)包本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种确定生物样品中分析物位置的方法，所述方法包括：(a)将生物样品的部分设置于基材的多个孔中，其中所述多个孔中的孔包括包含多个捕获探针的表面，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条码和捕获域；(b)从生物样品释放分析物，其中所述分析物与捕获探针的捕获域杂交；和(c)确定(i)对应于分析物或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定生物样品中分析物的位置。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基材包含约100万个孔至约500万个孔。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中多个孔的每个孔是平底孔或圆底孔。4.根据权利要求1
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3中任一项所述的方法，其中所述多个孔中的每个孔包含六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。5.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有基本相同的周长。6.根据权利要求1
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4中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。7.根据权利要求1
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6中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。8.根据权利要求7所述的方法，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。9.根据权利要求1
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8中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。10.根据权利要求9所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。18.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面。19.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的一个
或多个侧表面。20.根据权利要求1
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17中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。21.根据权利要求1
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20中任一项所述的方法，其中步骤(a)中的设置是使用辊装置或冲压装置施加的压力进行的。22.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用寡核苷酸光刻将所述多个捕获探针连接到孔的表面。23.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用桥式扩增将所述多个捕获探针连接到孔的表面。24.根据权利要求1
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21中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前通过将多个可溶性水凝胶珠设置于孔中以将多个捕获探针设置于孔中，其中多个可溶性水凝胶珠包含多个捕获探针。25.根据权利要求1
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24中任一项所述的方法，其中步骤(c)中的释放包括裂解生物样品的部分。26.根据权利要求25所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(c)之前向所述多个孔的每个孔加入一种或多种裂解剂。27.根据权利要求25所述的方法，其中在步骤(a)中，所述多个孔的每个孔包含一种或多种裂解剂。28.根据权利要求1
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27中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括，在步骤(b)之前，对生物样品进行固定、染色和/或成像的一种或多种。29.根据权利要求1
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28中任一项所述的方法，其中所述生物样品在步骤(b)之前被设置于透明基材上。30.根据权利要求1
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29中任一项所述的方法，其中所述生物样品是组织样品。31.根据权利要求30所述的方法，其中所述组织样品是新鲜、冷冻的组织样品。32.根据权利要求30所述的方法，其中所述组织样品是固定的组织样品。33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组织样品是福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品。34.根据权利要求1
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33中任一项所述的方法，进一步包括(d)使用特异性结合到捕获域的分析物作为模板延伸捕获探针的末端。35.根据权利要求34所述的方法，其中步骤(d)进一步包括对(i)对应于分析物或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列进行测序。36.根据权利要求35所述的方法，其中所述测序是高通量测序。37.根据权利要求1
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36中任一项所述的方法，其中所述分析物是RNA。38.根据权利要求37所述的方法，其中所述RNA是mRNA。39.根据权利要求1
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36中任一项所述的方法，其中所述分析物是DNA。40.根据权利要求39所述的方法，其中所述DNA是基因组DNA。41.一种确定生物样品中分析物位置的方法，所述方法包括：(a)提供包括多个孔的基材，其中所述多个孔中的孔包含：(i)包含多个捕获探针的表面，其中所述多个捕获探针中的捕获探针包含空间条码和
捕获域；和(ii)多个分析物捕获剂，其中所述多个分析物捕获剂的分析物包含分析物结合部分、分析物结合部分条码和分析物捕获序列；(b)将生物样品设置于所述多个孔中；(c)从生物样品释放分析物，其中所述分析物由分析物捕获剂的分析物结合部分特异性结合，并且分析物捕获剂的分析物捕获序列由捕获探针的捕获域特异性结合；和(d)确定(i)对应于分析物结合部分条码或其互补物的序列，和(ii)对应于空间条码或其互补物的序列，并使用(i)和(ii)的序列以确定生物样品中分析物的位置。42.根据权利要求41所述的方法，其中所述基材包含约100万个孔至约500万个孔。43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述多个孔的每个孔是平底孔或圆底孔。44.根据权利要求41
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43中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含六边形、七边形、八边形、五边形、方形或圆形的周界。45.根据权利要求41
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44中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有基本相同的周长。46.根据权利要求41
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44中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔不具有基本相同的周长。47.根据权利要求41
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46中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约3μm至约7μm的平均直径。48.根据权利要求47所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约4μm至约6μm的平均直径。49.根据权利要求41
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48中任一项所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约12μm2至约30μm2的面积。50.根据权利要求49所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约15μm2至约27μm2的面积。51.根据权利要求50所述的方法，其中所述多个孔的每个孔包含开口和/或底部表面，所述开口和/或底部表面具有约18μm2至约24μm2的面积。52.根据权利要求41
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51中任一项所述的方法，其中所述所述多个孔的每个孔具有约10μm至约35μm的深度。53.根据权利要求52所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约15μm至约30μm的深度。54.根据权利要求53所述的方法，其中所述多个孔的每个孔具有约20μm至约25μm的深度。55.根据权利要求41
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54中任一项所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约20μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。56.根据权利要求55所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约10μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。57.根据权利要求56所述的方法，其中所述多个孔具有约7.0μm至约8.5μm的相邻孔之间的几何中心到中心间距。58.根据权利要求41
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57中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部
表面。59.根据权利要求41
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57中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的一个或多个侧表面。60.根据权利要求41
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57中任一项所述的方法，其中所述多个捕获探针设置于孔的底部表面和孔的一个或多个侧表面。61.根据权利要求41
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60中任一项所述的方法，其中步骤(b)中的设置是使用辊或冲压装置施加的压力进行的。62.根据权利要求41
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61中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用寡核苷酸光刻将所述多个探针连接到孔的表面。63.根据权利要求41
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61中任一项所述的方法，其中在步骤(a)之前使用桥式扩增将所述多个探针连接到孔的表面。64.根据权利要求41
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61中任一项所述的方法，其中在...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：一零x基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：