适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用，该方法通过设计捕获靶向区域的半闭合锁式探针，通过连接酶填补探针上的空缺，经滚环扩增实现对待检未知序列的测序，多轮连接测序可解析X个待检碱基。依据其探针设计特点，可对未知核酸序列测序，能应用于肿瘤点突变检测、连续突变检测等。可实现单细胞、单分子、单碱基分辨率的基因序列原位解读。该方法可进行高通量组织原位检测，获得组织样本不同细胞的目标序列的原位空间谱图，无需进行高难度的体外寡量特异性细胞富集建库测序。且信号解读不依赖于超分辨成像平台，在个体发育、遗传育种、肿瘤微环境及临床病理检测等领域均有较好的应用前景。病理检测等领域均有较好的应用前景。病理检测等领域均有较好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用


[0001]本专利技术涉及原位测序领域，具体涉及一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用。

技术介绍

[0002]细胞是生物体结构和功能的基本单位。自1839年细胞学说建立后，无数科学家致力于研究细胞的解构、功能及彼此间的关系等，以期探明生命的本质。1958年，沃森和克里克提出中心法则，阐述了遗传信息在生物大分子之间传递的顺序，分子生物学时代就此拉开序幕。在此基础上，基因组学、转录组学、蛋白组学等现代生物学科蓬勃发展，科学家们在探寻生命活动奥秘研究上扬帆起航。其中，mRNA由DNA转录而来，在核糖体的协助下合成蛋白质，是遗信息的传递者，蛋白质翻译的蓝图，在生命活动中起着至关重要的作用。迄今，全世界有数以万计的科研人员致力于mRNA的研究。
[0003]技术变革是推动研究发展的根本。早期对mRNA的研究受制于实验技术，需要先从细胞或组织中提取出mRNA，再通过Northern印迹杂交法(Northern blot)、荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time PCR，qPCR)、第一代测序技术等来研究。此类方法费时费力，能获取的信息也很有限。随着二代测序技术的推广，科学家们逐步实现了对mRNA的大规模并行测序，开发出一系列的RNA测序技术(RNA
‑
seq)。在过去的十年中，RNA
‑
seq已经成为在全转录组范围内分析差异基因表达和mRNA差异剪接的重要工具，包括单细胞基因表达、翻译和RNA结构等。
[0004]传统的RNA测序(如bulk RNA
‑
seq)是将一整块组织中的RNA提取出来进行建库、测序，获得此区域内各种细胞转录本的平均表达水平。但组织中不同细胞发挥的功能不同，mRNA表达水平也有差异，常规RNA
‑
seq的均一化策略会掩盖掉许多重要信息。为了探寻组织中不同细胞的特点和功能，2009年，汤富酬教授基于前人技术进行改良，形成了第一个的真正意义的单细胞RNA测序技术(single cell RNAsequencing,scRNA
‑
seq)。
[0005]2013年，Nature Method将年度技术授予单细胞测序。该技术能够提供每个细胞的RNA表达谱，并鉴定异质细胞群中的稀有细胞，极大推动了发育生物学、神经生物学、癌症机理等方面的研究。scRNA
‑
seq方法和bulk RNA
‑
seq技术共同发挥功能，为研究者们提供了关于组织或细胞群体的高度详细的数据，提高了人们对组织内细胞的身份信息和状态的认知。然而，此类方法共同的缺点是失去了mRNA在细胞中的空间信息。这类信息非常重要，因为特定的细胞类型及组织与生命活动密切相关。
[0006]为了对转录本的空间信息进行研究，以分析细胞环境与基因表达之间的密切关系，科学家们提出空间转录组学(spatial transcriptomics，ST)。其中，基于成像的RNA原位测序方法(in situ sequencing,ISS)，可以直接对处于组织环境中的细胞中的mRNA进行测序，这样既能得到单个细胞特定转录本的具体序列，还能得到其空间位置和对应的表达水平，能将获得的mRNA信息标定到它真实的地方，是相对理想的方式。
[0007]目前，常用的mRNA原位测序根据其捕获转录本的方法可分为两类：
[0008]1)一类是非靶向捕获转录本的方法，代表技术有FISSEQ、INSTA
‑
Seq。此类方法理论上能对捕获所有转录本，检测细胞内所有转录本的信息，但实际中此类技术特异性较差，获得的数据中rRNA信号较多，mRNA的检测效率较低，且往往步骤较繁琐，目前应用不多。
[0009]2)另一类方法为靶向捕获转录本的方法，代表技术为STARmap(Spatially
‑
resolved Transcript Amplicon Readout Mapping)。该类方法通常依赖锁式探针(padlock probe)，用此种探针对某一特定转录本进行原位捕获，此类方法通常较为灵敏、特异，但测序通量较低，一条锁式探针只能检测一个位点的一种突变，想要进行稍长的测序就需设计多条探针，操作繁琐且成本较高。
[0010]如图1所示：经典锁式探针在进行原位测序时，一旦待测序列上存在突变，则需要基于先验的知识设计并合成多种探针。当待测位点存在一个点突变时，因突变结果可能是A\T\C\G其中任意一种，需要分别合成出对应的探针，至少有4种，还需要知道突变碱基的具体位置，才能用经典的锁式探针捕获。一旦存在连续几个突变，甚至是多种突变同时出现，就需要设计大量的探针来检测。一次实验使用多种经典探针，不仅大大增加了成本，还会降低杂交效率、增加非特异性。
[0011]如何直接、靶向且简单地对核酸进行原位测序，是目前技术开发的当务之急。

技术实现思路

[0012]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法及其应用，本专利技术使用半闭合的锁式探针，特异性杂交目的核酸，通过连接的方式，将一段单链随机脱氧核糖核苷酸填补进锁式探针形成的Gap中，形成完整的环状结构，通过滚环扩增的方式原位放大捕获的信息，再通过连接测序对Gap中对应的序列进行解读，最后进行图像分析获得转录本的空间信息。该方法仅需4轮连接测序，即可测得核酸上连续4个碱基的序列。使用普通锁式探针，测得4个碱基序列需设置44＝256条探针，本方法仅需1条，大大减少了探针设计工作量和制备的成本。本专利技术可以直接原位测序RNA，无需将其反转录为cDNA，且保留了空间信息，减少操作步骤的同时提高了检测效率。该方法可检测一段未知序列，无需先验知识，特异性强，容错率高。
[0013]为实现上述目的，本专利技术所设计的技术方案如下：
[0014]本专利技术提供了一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，包括以下步骤：
[0015]1)探针的设计
[0016]根据待检序列筛选出杂交效率高、特异性好、无高级结构的靶向区域，设置杂交探针；其中，所述的杂交探针包括半闭合锁式探针和RCA引发探针；
[0017]所述半闭合锁式探针与待检序列的靶向序列互补后会在半闭合锁式探针5
’
和3
’
端间形成空缺，
[0018]所述空缺由X个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段(5
’‑
NNNN
‑3’
)填补并与待检序列的靶向序列(即为测序目标)互补；其中，X为2、3、4、5、6、7、8
……
；
[0019]2)探针预处理
[0020]对杂交探针中的半闭合锁式探针、X个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的5
’
端进行磷酸化；
[0021]3)样品杂交
[0022]在待测样本上制备一个反应腔本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：包括以下步骤：1)探针的设计根据待检序列筛选出杂交效率高、特异性好、无高级结构的靶向区域，设置杂交探针；其中，所述的杂交探针包括半闭合锁式探针和RCA引发探针；所述半闭合锁式探针与待检序列的靶向序列互补后会在半闭合锁式探针5
’
和3
’
端间形成空缺，所述空缺由X个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段填补并与待检序列的靶向序列互补；其中，X为2、3、4、5、6、7、8
……
；2)探针预处理对杂交探针中的半闭合锁式探针、X个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的5
’
端进行磷酸化；3)样品杂交在待测样本上制备一个反应腔室，用4％的多聚甲醛(PFA)对样本进行固定，然后用甲醇脱水和变性，再将含有杂交探针的体系加入其中孵育一段时间；4)连接反应将含有X个碱基的单链脱氧核糖核酸随机片段的连接体系加入到反应腔室中，使与待检序列互补配对的半闭合锁式探针上的空缺(Gap)被填补，形成闭合的环状结构；5)滚环扩增RCA引发探针同时与待检序列的靶向序列和半闭合锁式探针互补，在Phi29 DNA聚合酶的作用下，以RCA引发探针为引物，半闭合锁式探针形成的环状结构为模板，进行滚环扩增，将目标信号放大；6)对靶序列原位测序Ⅰ.原位测序将含有锚定引物和测序引物的测序体系加入反应腔室中进行原位测序反应，对半闭合锁式探针之间的空缺中第一位碱基对应的序列进行测序成像，解读待检序列的靶向序列的空间位置及序列信息；Ⅱ.同法依次解读半闭合锁式探针之间的空缺中其它位置碱基序列的信息；Ⅲ.对上述获得的多轮测序信息进行匹配，解读半闭合锁式探针之间形成空缺对应的靶向序列。2.根据权利要求1所述适用于原位检测连续多个核苷酸位点的测序方法，其特征在于：所述步骤1)中，待检序列的靶向序列由4段连续的靶序列A、D、B和C组成，所述半闭合锁式探针由5
’
端至3端
’
为A
’
序列，loop序列和B
’
...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，张凌凯，吴小凤，戴金霞，
申请(专利权)人：鲲羽生物科技江门有限公司，
类型：发明
国别省市：