本发明专利技术公开一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用，该方法将所有靶标分子分为锚定分子和N组稀疏分子，每轮通过连接测序的方式读取全部锚定分子和其中一组稀疏分子，直至N组稀疏分子读取完毕。通过N轮成像，有效地将无法解读的高密度靶标分子信号稀疏成N组低密度信号，再通过锚定分子配准将解读后的N组稀疏分子进行整合，确定高通量高密度的空间分布模式信息。该方法通过增加成像轮数，拆分、稀疏高密度图像，换取空间位置，解决荧光信号点光学拥挤和干扰问题，获取高密度信号点的空间位置，无需通过超分辨显微成像系统在单细胞水平实现高通量、高密度荧光信号的精准空间分辨的解析，打破目前的技术限制。打破目前的技术限制。打破目前的技术限制。
【技术实现步骤摘要】
运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用
[0001]本专利技术涉及高通量原位测序领域，具体涉及一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法及其应用。
技术介绍
[0002]细胞是生物体组织结构和功能的基本单位。传统高通量测序方法是针对大量细胞的遗传信息进行读取，得到这群细胞的“整体”表征。随着研究的深入，人们发现细胞间存在异质性，而传统测序方法已经无法挖掘这种“细节”。直到单细胞测序技术的出现，实现了从单细胞的精度在分子水平解析生命活动，对单个细胞进行特写，极大地推动了发育、癌症、神经、免疫等研究领域的发展。但在单细胞悬液的制备过程中，细胞本身的空间信息丢失，无法同时兼得细胞身份信息和位置信息。而传统的原位杂交技术，如单分子荧光原位杂交(smFISH)和RNAscope，能够同时展示空间和转录信息，具有高灵敏度和背景低的优点，但检测通量低，无法获得精细的转录谱。
[0003]为了解析单个细胞的结构与功能，能够同时展现单个细胞表达谱和空间信息的空间转录组学应运而生，其中以MERFISH(multiplexed error
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robust fluorescence in situ hybridization)、seqFISH(sequential fluorescence in situ hybridization)、seqFISH+、STARmap(Spatially
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resolved Transcript Amplicon Readout Mapping)为代表的基于图像从而进行高通量的单分子荧光原位检测的方法应用较为广泛。目前MERFISH单个细胞中可检测～1000个基因，SeqFISH+在单个细胞中实现了10000个基因的检测，这种基于单分子杂交的方法通过条形码的引入和使用不同序列的荧光探针进行迭代成像，稀释成多个独立的图像，再重新组合构建完整图像，实现高通量的原位检测。基于原位测序的方法展示转录组的STARmap目前单个细胞的检测上限接近1020个基因，其利用带有barcode序列的锁式探针对转录本进行杂交，再通过滚环扩增的方式对信号进行扩大，使用连接测序的方法对barcode序列进行读取，实现高通量原位还原转录组信息。
[0004]空间组的高速发展为细胞构筑的刻画提供了坚实的基础，但是仍有许多不足需要进行解决。基于单分子杂交的方法探针制备繁琐且大量的荧光读取探针成本高；操作步骤繁杂，需要多次杂交
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成像
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探针剥离循环操作，对系统稳定性要求高；由于缺失“定位点”，光学畸变使得多轮信号的配准难度大；需要借助超分辨荧光显微镜、对仪器要求极高。基于原位测序杂交的方法利用滚环扩增放大信号，单个信号点体积大于单分子杂交，由于衍射极限的存在，限制了检测通量。每个细胞有数万到数十万个RNA，想要一次性全局分析整个细胞的转录谱难度极高；因为由于衍射极限的存在，会导致光学拥挤，对仪器的光学分辨率要求极高，所以以较低光学分辨率进行高精度原位成像一直是单细胞生物学中的一项重大挑战。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种运用于空间组学高密度信号
分解稀疏解读的方法及其应用，本专利技术根据靶标分子数量(DNA通过拷贝数判定、RNA或蛋白质通过表达丰度判定)进行排序，选取排列在中间位置的1
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5个靶标分子作为锚定分子，将除锚定分子外的靶标分子根据通量与数量分为N组稀疏分子，每轮通过连接测序的方式读取全部锚定分子和其中一组稀疏分子，直至N组稀疏分子读取完毕。通过N轮成像，有效地将无法解读的高密度靶标分子信号稀疏成N组低密度信号，再通过锚定分子配准将解读后的N组稀疏分子进行整合，确定高通量高密度的空间分布模式信息。该方法通过增加成像轮数，拆分、稀疏高密度图像，换取空间位置，解决荧光信号点光学拥挤和干扰问题，获取高密度信号点的空间位置，无需通过超分辨显微成像系统在单细胞水平实现高通量、高密度荧光信号的精准空间分辨的解析，打破目前的技术限制。
[0006]为实现上述目的，本专利技术所设计一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，包括以下步骤：
[0007]1)待测靶标分子分类：
[0008]选取待检对象中的待靶标分子组成的靶标组，将靶标分子按其数量(DNA通过拷贝数判定、RNA或蛋白质通过表达丰度判定)进行排序，选取排列在中间位置的1
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5个靶标分子作为锚定分子；将除锚定分子外的靶标分子作为稀疏分子；并以稀疏分子的通量和数量为基准，将稀疏分子分为N个稀疏组，即为第一稀疏组
…
第N稀疏组(使每组中稀疏分子数量总和尽可能相同，在后续的读取过程中，第一轮成像读取第一组稀疏分子与锚定分子，第二轮成像读取第二组稀疏分子与锚定分子，以此类推)，其中，
[0009]N的取值满足在成像时每轮成像后的荧光信号在光学衍射极限内可分辨即可，N≥2；
[0010]2)杂交探针设计和制备
[0011]从待检测对象的待靶标分子中选出GC含量为40％～60％、特异性高、无高级结构的靶序列区域设计和制备杂交探针；其中，所述杂交探针包括锁式探针、RCA引发探针、读取探针和测序探针；
[0012]3)探针预处理：
[0013]对锁式探针的5
’
端进行磷酸化处理，再将其产物与RCA引发探针进行退火结合；对读取探针的5
’
端进行磷酸化处理。
[0014]4)样品杂交
[0015]在反应腔室内依次对待检对象进行多聚甲醛固定、甲醇脱水和蛋白酶消化处理，再将含有锁式探针、RCA引发探针的杂交液加入反应腔室中孵育过夜。
[0016]5)连接反应
[0017]通过连接酶的连接，锁式探针与RNA上的靶序列互补配对并形成闭合的环状结构
[0018]6)滚环扩增
[0019]通过Phi29 DNA聚合酶的作用下，以RCA引发探针为引物，连接过后的锁式探针闭合环状结构为模板，进行滚环扩增，放大信号。
[0020]7)原位测序解读空间信息
[0021](1)将N个稀疏组由第一组开始至第N组依次进行读取：
[0022]a.第一轮读取：在T4连接酶的作用下，读取探针(读取探针Seq
锚
和Seq1探针)和测序探针(测序探针为常用原位测序探针)进行连接测序反应，对锁式探针的barcode碱基进
行测序，通过逐层成像，叠加信号进行最大投影，解读第一轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和第一组稀疏分子的barcode信息；使用信号剥离液去除读取探针和测序探针；
[0023]b.其余轮读取：按上述步骤依次对其它稀疏组的锁式探针的barcode碱基进行测序，解读每轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息，直至解读完第N轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息；
[0024](2)本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种运用于空间组学高密度信号分解稀疏解读的方法，其特征在于：包括以下步骤：1)待测靶标分子分类：选取待检对象中的靶标分子组成的靶标组，将靶标分子按其数量进行排序，选取排列在中间位置的1
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5个靶标分子作为锚定分子；将除锚定分子外的靶标分子作为稀疏分子；并以稀疏分子的通量和数量为基准，将稀疏分子分为N个稀疏组，即为第一稀疏组
…
第N稀疏组，其中，N的取值满足在成像时每轮成像后的荧光信号在光学衍射极限内可分辨即可，N≥2；2)杂交探针设计和制备从待检测对象的靶标分子中选出GC含量为40％～60％、特异性高、无高级结构的靶序列区域设计和制备杂交探针；其中，所述杂交探针包括锁式探针、RCA引发探针、读取探针和测序探针；3)探针预处理：对锁式探针的5
’
端进行磷酸化处理，再将其产物与RCA引发探针进行退火结合；对读取探针的5
’
端进行磷酸化处理；4)样品杂交在反应腔室内依次对待检对象进行多聚甲醛固定、甲醇脱水和盐酸通透处理，再将含有锁式探针、RCA引发探针的杂交液加入反应腔室中孵育过夜；5)连接反应通过连接酶的连接，使锁式探针与靶标分子的靶序列互补配对并形成闭合的环状结构6)滚环扩增通过Phi29 DNA聚合酶的作用下，以RCA引发探针为引物，连接过后的锁式探针闭合环状结构为模板，进行滚环扩增，放大信号；7)原位测序解读空间信息(1)将N个稀疏组由第一组开始至第N组依次进行读取：a.第一轮读取：在T4连接酶的作用下，读取探针和测序探针进行连接测序反应，对锁式探针的barcode碱基进行测序，通过逐层成像，叠加信号进行最大投影，解读第一轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和第一组稀疏分子的barcode信息；使用信号剥离液去除读取探针和测序探针；b.其余轮读取：按上述步骤依次对其它稀疏组的锁式探针的barcode碱基进行测序，解读每轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息，直至解读完第N轮的每个荧光信号信息对应的锚定分子和该组稀疏分子的barcode信息；(2)解读空间信息a.根据锚定分子对应的荧光信号将N张图片进行配准重合形成一张图片，即为靶标组中的靶标分子对应的高密度荧光信息；b.将荧光信号与N组的barcode信息配对，将N组稀疏组的稀疏分子的barcode信息和锚定分子的barcode信息整合在一起，得到整合的所有稀疏组的barco...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，李月，戴金霞，吴小凤，徐伟泽，
申请(专利权)人：鲲羽生物科技江门有限公司，
类型：发明
国别省市：
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