一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法技术

本发明专利技术涉及分子生物学技术应用领域，具体为一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，包括步骤：S1、制备杂交探针：合成引物片段，并对所述探针进行荧光标记；所述的荧光标记包括组合色荧光标记；S2、杂交：制备杂交片，将所制得的杂交片与S1中经过荧光标记的杂交探针进行杂交反应；S3、成像，获取标记信息。本发明专利技术的原位杂交法提高了检测的准确率，并且大大的增加了检测位点的数目，只需要一轮杂交。就可以同时对至少五种基因位点进行检测，大大的增加检测的效率，使操作更加的简便快捷，扩大了应用范围。扩大了应用范围。扩大了应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法


[0001]本专利技术涉及分子生物学技术应用领域，具体为一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，是一种多色荧光原位检测方法的应用。

技术介绍

[0002]原位核酸分子杂交技术简称原位杂交(in situ hybridization ISH)是应用已知碱基顺序并带有标记物的核酸探针与组织、细胞中待检测的核酸按碱基配对的原则进行特异性结合而形成杂交体，然后再应用与标记物相应的检测系统，通过组织化学或免疫组织化学方法在被检测的核酸原位形成带荧光的杂交信号，在显微镜或电子显微镜下进行细胞内定位。这一技术为研究单一细胞中DNA和编码各种蛋白质、多肽的相应mRNA的定位提供了手段，使从分子水平研究细胞内基因表达及有关基因调控提供了有效的工具。可视为组织化学或免疫细胞化学中革命性的突破。原位杂交技术已应用于基础研究如基因组图(Gene mapping)，转基因检测，基因表达定位(localization of gene expression)，核DNA和RNA的mRNA的排列和运输(arrangement and transport of mNA)，复制(replication)和细胞的分类(Sorting of cells)。临床研究应用在细胞遗传学(Cytogenetics)，产前诊断(Prenatal diagnosis)，肿瘤和传染性疾病的诊断，生物学剂量测定(biological dosimetry)和病毒学的病原学诊断等。随着核酸探针的制备,标记方法和基本操作方法的不断改进，新的技术不断涌现，相信在不久的将来，原位杂交技术将会更广泛的被应用于各个学科，并不断为生命科学提供新的资料，开拓新的领域。
[0003]肿瘤疾病的发生、发展过程中，肿瘤细胞往往会出现染色体、基因等发现异常变化，包括基因变异、基因多拷贝、染色体非整倍性等。FISH(荧光原位杂交，Fluorescence in situ hybridization)能通过检测染色体和基因的异常变化，供某些肿瘤的预后或者诊断参考，例如实体瘤中的宫颈癌、非小细胞肺癌、乳腺癌和膀胱癌等，以及血液肿瘤中的慢性粒细胞性白血病、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病等疾病。
[0004]FISH技术也有其局限性，首先它只能用特异的探针检测已知的染色体异常，其次一种探针往往只能检测出一种异常，对同时存在的多种异常需采用多个探针检测，成本势必增加。
[0005]目前的荧光原位杂交法，一张杂交片最多实现三种颜色荧光。在实际操作中，DAPI一般用来标记细胞核，因此对于普通荧光显微镜来说，一张杂交片只能同时实现红光和绿光两种检测，即一张杂交片检测两种不同的基因或者染色体。如果杂交更多的基因，则需要另外增加杂交片或者另外配备其他荧光色，增加了操作人员的工作量，同时也提高了检测成本。另外，现有的荧光原位杂交法，通常是一张杂交片子只能检测一种目的基因，如果同时需要检测多种基因，也可选择进行多轮杂交。多轮杂交在同一张杂交片前一次杂交、检测结束后，需要进行清洗后再杂交、检测，如此循环实现检测多种基因的目的。目前，多轮杂交的过程中普遍存在清洗不彻底的情况，对后续检测带来干扰，影响检测结果的准确性，同时多轮杂交的时间周期很长，大大减低了基因检测的效率。

技术实现思路

[0006]基于此，本专利技术的目的在于，提供一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法。本专利技术的原位杂交法提高了检测的准确率，并且大大的增加了检测位点的数目，只需要一轮杂交。就可以同时对至少五种基因位点进行检测，大大的增加检测的效率，使操作更加的简便快捷，扩大了应用范围。
[0007]本专利技术的技术方案如下：
[0008]一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，包括步骤：
[0009]S1、制备杂交探针：合成引物片段，并对所述探针进行荧光标记；
[0010]S2、杂交：制备杂交片，将所制得的杂交片与S1中经过荧光标记的杂交探针进行杂交反应；
[0011]S3、成像，获取标记信息；
[0012]所述S1中的荧光标记包括组合色荧光标记。
[0013]进一步的，所述S1的杂交探针制备操作包括：
[0014]S11、对合成片段进行PCR扩增，回收扩增产物；
[0015]S12、将S11回收的扩增产物进行体外转录，收集转录片段；
[0016]S13、将S12的转录片段分别进行反转录，反转录体系中包括带有荧光修饰的dUTP，回收反转录产物。
[0017]进一步的，所述S11中的扩增体系为：
[0018]buffer：20μl；
[0019]引物片段混合液(5ng/μl)：1μl；
[0020]dNTP
‑
mix(10mM)：1μl；
[0021]扩增引物MIX(10μM/μl)：4μl；
[0022]扩增酶：1μl；
[0023]ddH20：12μl。
[0024]进一步的，所述S11中的扩增程序为：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；扩增19个循环。
[0025]进一步的，所述S13中的反转录体系为：
[0026]5x逆转录buffer：5μl；
[0027]dNTP mix：2.8μl；
[0028]带有荧光修饰的dUTP(1mM)：2μl；
[0029]反转录引物(20μM)：1μl；
[0030]逆转录酶混合液：2μl；
[0031]RNA：8.2μl。
[0032]进一步的，所述S13中的反转录程序为：25℃，5min；37℃，45min；85℃，5min。
[0033]进一步的，所述S13中操作还包括单链DNA杂交探针的纯化：反转结束后，向反转体系中加入20μl的0.25M EDTA 0.5M NaOH buffer，95℃反应10min。
[0034]进一步的，所述带有荧光修饰的dUTP为用至少两种基本颜色的荧光修饰剂对dUTP分别进行组合修饰得到的带有荧光修饰的dUTP。
[0035]进一步的，所选基本颜色数量为n，N1为单色可修饰的dUTP数量(即单色编码基因
数量)，N2为双色可修饰的dUTP的数量(即双色编码基因数量)，N3为三色可修饰的dUTP数量(即三色编码基因数量)，以此类推，N(n
‑
1)为(n
‑
1)色可修饰的dUTP数量(即(n
‑
1)色编码基因数量)，Nn为n色可修饰的dUTP数量(即n色编码基因数量)。N为n个基本颜色所能修饰的dUTP的总数(即编码的基因总数量)；N
max
为n个基本颜色所能修饰的dUTP总数的最大值(即编码的基因数量的最大值)。数量关系为：编码的基因数量的最大值)。数量关系为：根据实际需要进行组合标记，N为N1与N2至Nn中至少一个值的和；N的最大值N
max
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，其特征在于，包括步骤：S1、制备杂交探针：合成引物片段，并对所述探针进行荧光标记；S2、杂交：制备杂交片，将所制得的杂交片与S1中经过荧光标记的杂交探针进行杂交反应；S3、成像，获取标记信息；所述S1中的荧光标记包括组合色荧光标记。2.根据权利要求1所述的通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，其特征在于，所述S1的杂交探针制备操作包括：S11、对合成片段进行PCR扩增，回收扩增产物；S12、将S11回收的扩增产物进行体外转录，收集转录片段；S13、将S12的转录片段分别进行反转录，反转录体系中包括带有荧光修饰的dUTP，回收反转录产物。3.根据权利要求2所述的通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，其特征在于，所述S11中的扩增体系为：buffer：20μl；5ng/μl的引物片段混合液：1μl；10mM的dNTP
‑
mix：1μl；10μM/μl的扩增引物混合液：4μl；扩增酶：1μl；ddH20：12μl；所述S11中的扩增程序为：95℃，30s；60℃，30s；72℃，30s；扩增19个循环。4.根据权利要求2所述的通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，其特征在于，所述S13中的反转录体系为：5x逆转录buffer：5μl；dNTP mix：2.8μl；1mM的带有荧光修饰的dUTP：2μl；反转录引物(20μM)：1μl；逆转录酶混合液：2μl；RNA：8.2μl；所述S13中的反转录程序为：25℃，5min；37℃，45min；85℃，5min。5.根据权利要求2所述的通过组合色对基因组多位点同时检测的原位杂交方法，其特征在于，所述S13中操作还...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智慧，闫科技，
申请(专利权)人：鲲羽生物科技江门有限公司，
类型：发明
国别省市：