多重基因荧光原位杂交的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了一种多重基因荧光原位杂交的方法及其应用。该方法包括：将针对多个待测基因的多个荧光探针混合，得到混合探针；将混合探针与待测的样本进行荧光原位杂交，得到杂交后的样本；其中，多个待测基因的5

【技术实现步骤摘要】
多重基因荧光原位杂交的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及荧光原位杂交领域，具体而言，涉及一种多重基因荧光原位杂交的方法及其应用。

技术介绍

[0002]染色体易位导致的基因融合，通常采用荧光原位杂交(FISH)的方法进行检测。荧光原位杂交(FISH)是20世纪80年代发展起来的一种分子生物学与细胞遗传学相结合的新技术，其原理是利用荧光标记的核酸探针与样本中核酸的互补区域进行杂交，通过荧光信号判读目标核酸区域是否存在以及定位。
[0003]基因易位突变的FISH检测，通常采用分离探针法。对于一个基因来说，需设计5
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探针及3
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探针。在正常染色体上，两个探针位置相邻；当发生基因易位时，5
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探针及3
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探针分离。这一检测方法，不需要事先知道基因易位的伙伴基因，因此具有较高的检出率。但面临需要对多个基因进行检测的情况时，往往需要做多个FISH，探针成本高，实验过程也费工费时。
[0004]为了能够同时检测多个基因，现有文献也有采用多种不同颜色荧光标记的探针。但由于滤光片的限制，常规实验室里的荧光显微镜FISH通常只能同时检测2种颜色的探针。无法满足需求。即使采用不同的滤光片，最多也只能在可见光范围内容纳4种颜色的探针，如果一个基因的5
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及3
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标记为不同颜色的荧光素，则只能同时检测两个基因。如果采用更多不同颜色的荧光素，则需要特殊的显微镜和算法，一般的实验条件难以实现。
[0005]综上所述，多个基因易位的检测面临特殊的挑战。

技术实现思路

[0006]本专利技术的主要目的在于提供一种多重基因荧光原位杂交的方法及其应用，以解决现有技术中的染色体易位的荧光原位杂交多重检测步骤复杂、成本高的问题。
[0007]为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种多重基因荧光原位杂交的方法，该荧光原位杂交的方法包括：将针对多个待测基因的多个荧光探针混合，得到混合探针；将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交，得到杂交后的样本；其中，多个待测基因的5
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端的荧光探针的荧光标记相同，多个待测基因的3
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端的荧光探针的荧光标记相同，且多个待测基因的5
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端的荧光探针的荧光标记与多个待测基因的3
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端的荧光探针的荧光标记不同。
[0008]进一步地，在将针对多个待测基因的多个荧光探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，方法还包括：针对多个待测基因设计多个荧光探针的步骤。
[0009]进一步地，多个待测基因的5
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端的荧光探针的荧光标和多个待测基因的3
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端的荧光探针的荧光标记，两种荧光标记的发射光谱峰值的波长差大于二者发射光谱峰值半峰宽之和的80％；更优选地两种荧光标记选自如下任一组：a)罗丹明与FITC；b)FITC与Cy5；c)德克萨斯红(Texas Red)。
[0010]进一步地，在将多个待测基因的多个荧光探针进行混合时，混合的步骤包括：对每个待测基因的荧光探针的信号强度进行测试，并根据各待测基因的荧光探针的信号强度调整各荧光探针的混合浓度后再混合；优选地，混合探针中各荧光探针的信号强度一致。
[0011]进一步地，在得到混合探针后，以及在将混合探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，荧光原位杂交方法进一步包括采用阴性样本和阳性样本，分别对混合探针的荧光原位杂交结果进行阴性荧光信号和阳性荧光信号的测试和验证；其中，阴性荧光信号的测试和验证包括：所有待测基因的5
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端和3
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端的荧光探针的荧光标记的信号都能检测到，和/或，每个待测基因的5
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端的荧光探针的荧光标记的信号与每个待测基因的3
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端的荧光探针的荧光标记的信号的位置至少部分重叠，或者距离小于等于一个信号点宽度；阳性荧光信号的测试和验证包括：检测至少有一个荧光探针的荧光标记的信号为单独的5
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端或3
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端的荧光探针的荧光标记的信号，和/或至少有一个荧光探针的荧光标记的5
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端的信号与3
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端的荧光探针的荧光标记的信号之间的距离大于1个信号点的宽度。
[0012]进一步地，在对阴性荧光信号和阳性荧光信号进行测试和验证的过程中，对于难以判定每个待测基因的5
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端的荧光标记的信号与3
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端的荧光探针的荧光标记的信号之间的距离是否大于一个信号点的宽度或是否小于等于一个信号点的宽度时，荧光原位杂交方法还包括：对混合探针所对应的多个待测基因进行逐一验证。
[0013]进一步地，在测试和验证阴性荧光信号和阳性荧光信号之后，荧光原位杂交方法进一步包括确定阳性判读阈值的步骤：优选地，利用混合探针对阴性样本中100个细胞中出现阳性荧光信号的细胞的个数进行统计，并计算出平均值和方差，并根据平均值和方差确定阳性判读阈值。
[0014]进一步地，阳性判读阈值为平均值+n倍方差，当待测样本的测定值大于平均值+n倍方差时，将待测样本判读为阳性样本，当待测样本的测定值小于平均值+nSD时，将待测样本判读为阴性样本，其中，2≤n≤4，更优选2≤n≤3。
[0015]进一步地，待测样本及待测样本对应的阴性样本和阳性样本为细胞学滴片样本或石蜡切片样本。
[0016]根据本申请的第二个方面，还提供了上述荧光原位杂交的方法在检测染色体易位突变中的应用，该应用包括检测植物或微生物中的染色体易位突变。
[0017]应用本专利技术的技术方案，本申请的荧光原位杂交方法，通过将多个待测基因均采用相同的荧光标记组合进行合并检测，仅涉及2种荧光素，不仅无需使用4-6种荧光素制备不同基因的探针，因此大大降低探针的成本；而且一次检测多个基因，大大简化了检测步骤。此外，该方法因仅采用两种荧光素，医学实验室常用的荧光显微镜均可进行观察，而无需特殊的滤光片或特种图像处理方法。进一步地，判读方法也简单，实验人员无需特殊的培训。
附图说明
[0018]构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：
[0019]图1A示出了本申请优选实施例中的待测样本的多个待测基因进行荧光原位杂交多重检测的探针设计示意图；其中，5
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FISH探针均设计为一种荧光标记，在此采用FITC标记
的荧光探针(显示绿色荧光，下同)，3
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FISH探针均设计为另一种荧光标记，在此显示为罗丹明(Rhodamine)标记的荧光探针(显示红色荧光，下同)。
[0020]图1B示出了本申请优选实施例中探针信号的判断规则的示意图；Rhodamine标记的荧光探针(红色荧光)与FITC标记的荧光探针(绿色荧光)的相对位置分为相邻、可疑、分离三种模式本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种多重基因荧光原位杂交的方法，其特征在于，所述方法包括：将针对多个待测基因的多个荧光探针混合，得到混合探针；将所述混合探针与待测样本进行荧光原位杂交，得到杂交后的样本；其中，多个所述待测基因的5
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端的所述荧光探针的荧光标记相同，多个所述待测基因的3
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端的所述荧光探针的荧光标记相同，且多个所述待测基因的5
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端的所述荧光探针的荧光标记与多个所述待测基因的3
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端的所述荧光探针的荧光标记不同。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在将针对多个待测基因的多个荧光探针与待测样本进行荧光原位杂交之前，所述方法还包括：针对多个所述待测基因设计多个所述荧光探针的步骤。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，5
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端的所述荧光探针的荧光标记和3
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端的所述荧光探针的荧光标记的发射光谱峰值的波长差大于二者发射光谱峰值半峰宽之和的80％；优选地，选自如下任一组：a)罗丹明与FITC；b)FITC与Cy5；c)FITC与德克萨斯红。4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在将多个所述待测基因的多个所述荧光探针进行混合时，所述混合的步骤包括：对每个所述待测基因的所述荧光探针的信号强度进行测试，并根据各所述待测基因的所述荧光探针的信号强度调整各所述荧光探针的混合浓度后再混合；优选地，所述混合探针中各所述荧光探针的信号强度一致。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在得到所述混合探针后，以及在将所述混合探针与所述待测样本进行荧光原位杂交之前，所述荧光原位杂交方法进一步包括：采用阴性样本和阳性样本，分别对所述混合探针的荧光原位杂交结果进行阴性荧光信号和阳性荧光信号的测试和验证；其中，所述阴性荧光信号的测试和验证包括：所有所述待测基因的5
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端和3
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端的所述荧光探针的荧光标记的信号都能检测到，和/或，每个所述待测基因的5
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端的所述荧光探...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁凤，王芳，高梦娇，凌萧洁，李轶亢，陈皓媛，张峰，
申请(专利权)人：嘉兴雅康博医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：