DNA的标记制造技术

本文中描述了标记DNA分子的方法，所述方法包括使用一种或多种dCas蛋白和一种或多种标记的向导RNA(gRNA)。在某些实施方式中，将所述标记的DNA分子在可以对它们进行分析的流体纳米通道中拉伸。纳米通道中拉伸。纳米通道中拉伸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】DNA的标记
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2018年6月25日提交的美国临时专利申请系列号62/689,650和2018年7月11日提交的美国临时专利申请系列号62/696,696在35 U.S.C.
§
119(e)下的利益，这些相关申请的内容为所有目的整体通过参考并入本文。
[0003]序列表引用
[0004]本申请与电子格式的序列表一起提交。所述序列表作为名为“Sequence_Listing_BNGEN_049WO.txt”的文件提供，所述文件在2019年6月23日生成，大小为1千字节。所述序列表的电子格式中的信息整体通过参考并入本文。


[0005]本文中的实施方式总的来说涉及DNA分子的标记例如基因组标记，用于纳米通道中的线性化DNA的分析。

技术介绍

[0006]流体纳米通道中的基因组作图是一种能够在下一代测序(NGS)的检测范围之外的兆碱基长度的DNA分子中寻找基因组结构变异(SV)的鲁棒技术。这些在流体通道中的基因组作图技术例如切口标记物修复染色化学(NLRS)或使用直接标记物的直接标记(非破坏性)和染色化学(DLS)(两者均来自于Bionano Genomics,San Diego,CA)，能够为包括30Gbp Axolotl基因组在内的大且复杂的植物和动物基因组产生结构准确的基因组组装体。
[0007]源自于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的II型簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-CRISPR相关半胱天冬酶9(Cas9)系统，由于其靶序列可定制性以及高的结合和酶促效率，已变成用于靶向基因组编辑的革命性工具。为了实现位点特异性DNA识别和切割，Cas9蛋白与CRISPR RNA(crRNA)和与所述crRNA部分互补的反式激活crRNA(tracrRNA)的双链体形成核糖核蛋白(RNP)复合体。所述Cas9的HNH和RuvC样核酸酶结构域切割两条DNA链，在由结合的crRNA转录本内大约20个核苷酸的种子序列所定义的位点处产生双链断裂(DSB)。

技术实现思路

[0008]某些实施方式包括一种在靶序列处标记DNA的方法。所述方法可以包括将所述DNA与第一dCas蛋白和包含第一crRNA和含有第一标记物的第一tracrRNA的第一标记的向导RNA(gRNA)相接触，其中所述第一crRNA与所述DNA的第一靶序列或其部分互补。所述方法可以包括将所述DNA、第一dCas蛋白和第一标记的gRNA温育，其中所述第一dCas蛋白、DNA和第一标记的gRNA形成复合体，其中所述第一crRNA与所述第一靶序列或其部分杂交。因此，所述DNA可以在第一靶序列处被标记，以形成标记的DNA。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述DNA与第二dCas蛋白和包含第二crRNA和含有不同于所述第一标记物的第二标记物的第二tracrRNA的第二标记的gRNA相接触，其中所述第二crRNA可以与所述DNA的第二靶序
列或其部分互补。所述方法还可以包括将所述DNA与所述第二标记的gRNA温育，其中所述第二dCas蛋白、DNA和第二标记的gRNA形成第二复合体，其中所述第二crRNA与所述第二靶序列或其部分杂交。因此，所述DNA可以在所述第二靶序列处用所述不同的标记物标记。在某些实施方式中，将所述DNA与所述第一标记的gRNA和第二标记的gRNA同时相接触，并将所述DNA与所述第一dCas蛋白、第二dCas蛋白、第一标记的gRNA和第二标记的gRNA同时温育。在某些实施方式中，所述DNA在包括接触和温育步骤并至少直至形成标记的DNA的整个方法中保持完整。在某些实施方式中，所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者在包含多个不适合于基于基序的酶促标记例如切口酶标记的重复序列或结构变体的区域中。在某些实施方式中，所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者在据预测在切口平移标记后形成和/或易于形成脆性位点的区域中。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述第一靶序列和/或第二靶序列选择成在包含多个不适合于基于基序的酶促标记例如切口酶标记的重复序列或结构变体的区域中。在某些实施方式中，所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者被选择成在据预测在切口平移标记后形成和/或易于形成脆性位点的区域中。在某些实施方式中，所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者由在切口标记后不包含分布不均匀的标记物的基因组区域构成。在某些实施方式中，所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者由重复的序列构成。在某些实施方式中，所述方法不包括切口标记。在某些实施方式中，所述标记的DNA能够在流体纳米通道中线性化后保持完整。在某些实施方式中，所述标记的DNA在流体纳米通道中线性化后保持完整。在某些实施方式中，所述方法还包括将所述标记的DNA在流体纳米通道中线性化，其中所述DNA在所述线性化后保持完整。在某些实施方式中，所述方法还包括在所述流体纳米通道中检测所述线性化的DNA上所述第一标记物与第二标记物之间的相对距离。所述流体纳米通道可以例如具有至少10nm的长度和小于1000nm的横截面直径。在某些实施方式中，所述第一dCas是dCas9。在某些实施方式中，所述第二dCas是dCas9。所述第一dCas和第二dCas中的至少一者可以在HNH结构域和/或RuvC样结构域中包含一个或多个突变或一个或多个缺失。在某些实施方式中，所述第一dCas未被标记。在某些实施方式中，所述第二dCas未被标记。在某些实施方式中，所述第一crRNA和第二crRNA中的至少一者包含与所述第一和第二靶序列或其部分中的一者或多者互补的约10-40个核苷酸的序列，例如约10-30寡核苷酸、约10-20个核苷酸、约15-30个核苷酸、约15-25个核苷酸、约20-30个核苷酸或约20-40个核苷酸。在某些实施方式中，所述温育包含所述第一dCas蛋白、第二dCas蛋白、第一标记的gRNA和第二标记的gRNA中的一者或多者，其浓度为每150ng所述用于杂交的DNA约120nM(每ng DNA约0.8nM)，例如每150ng DNA不超过或不超过约5nM、10nM、15nM、20nM、50nM、80nM、100nM、110nM、120nM、130nM、140nM、150nM、200nM、250nM、300nM、400nM、450nM或500nM，包括所列出的任两个值之间的范围，例如5nM至25nM、5nM至20nM、5nM至15nM、5nM至500nM、10nM至25nM、10nM至20nM、10nM至15nM、10nM至500nM、50nM至500nM、100nM至500nM、120nM至500nM、5nM至300nM、10nM至300nM、50nM至300nM、100nM至300nM、120nM至300nM、5nM至200nM、10nM至200nM、50nM至200nM、100nM至200nM、120nM至200nM、5nM至120nM、10nM至120nM、50nM至120nM或100nM至120nM。在某些实施方式中，所述浓度为本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种在靶序列处标记DNA的方法，所述方法包括：将包含第一靶序列的DNA与下述组分相接触：第一dCas蛋白；和第一标记的向导RNA(gRNA)，其包含第一crRNA和包含第一标记物的第一tracrRNA，其中所述第一crRNA与所述第一靶序列或其部分互补；将所述第一DNA、第一dCas蛋白和第一标记的gRNA温育，从而使所述第一dCas蛋白、DNA和第一标记的gRNA形成复合体，其中所述第一crRNA与所述第一靶序列或其部分杂交，由此在所述第一靶序列处标记所述DNA，以形成标记的DNA。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA包含第二靶序列，并且所述方法还包括：将所述DNA与下述组分相接触：第二dCas蛋白；和第二标记的gRNA，其包含第二crRNA和包含不同于所述第一标记物的第二标记物的第二tracrRNA，其中所述第二crRNA与第二靶序列或其部分互补；并且将所述DNA与所述第二dCas蛋白、第二标记的gRNA温育，其中所述第二dCas蛋白、DNA和第二标记的gRNA形成第二复合体，其中所述第二crRNA与所述第二靶序列或其部分杂交，由此在所述第二靶序列处用所述第二标记物标记所述DNA。3.根据权利要求2所述的方法，其中将所述DNA与所述第一标记的gRNA和第二标记的gRNA同时相接触，并且其中将所述DNA与所述第一dCas蛋白、第二dCas蛋白、第一标记的gRNA和第二标记的gRNA同时温育。4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述DNA在整个所述方法中保持完整。5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者在包含多个不适合于酶促基序标记的重复序列或结构变体的区域中。6.根据权利要求1-5中的任一项所述的方法，其中所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者在据预测在切口平移标记后形成或易于形成脆性位点的区域中。7.根据权利要求1-6中的任一项所述的方法，其中所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者由在切口标记后不包含分布不均匀的标记物的基因组区域构成。8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其还包括将所述第一靶序列、第二靶序列或两者选择成在包含多个不适合于酶促基序标记的重复序列或结构变体的区域中。9.根据权利要求5或8所述的方法，其中所述酶促基序标记是切口酶标记。10.根据权利要求1-9中的任一项所述的方法，其中将所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者选择成在据预测在切口平移标记后形成脆性位点的区域中。11.根据权利要求1-10中的任一项所述的方法，其中所述第一靶序列和第二靶序列中的至少一者由重复的序列构成。12.根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中所述标记的DNA在流体纳米通道中线性化后保持完整。13.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其还包括将所述标记的DNA在流体纳米通道中线性化，其中所述DNA在所述线性化后保持完整。14.根据权利要求13所述的方法，其还包括在所述流体纳米通道中检测所述线性化的
DNA上所述第一标记物与第二标记物之间的相对距离。15.根据权利要求12-14中的任一项所述的方法，其中所述流体纳米通道具有至少10nm的长度和小于1000nm的横截面直径。16.根据权利要求1-15中的任一项所述的方法，其中所述第一dCas蛋白是dCas9。17.根据权利要求2-16中的任一项所述的方法，其中所述第二dCas蛋白是dCas9。18.根据权利要求1-17中的任一项所述的方法，其中所述第一dCas蛋白在HNH结构域和/或RuvC样结构域中包含一个或多个突变和/或一个或多个缺失。19.根据权利要求2-18中的任一项所述的方法，其中所述第二dCas蛋白在HNH结构域和/或RuvC样结构域中包含一个或多个突变和/或一个或多个缺失。20.根据权利要求1-19中的任一项所述的方法，其中所述第一dCas蛋白未被标记。21.根据权利要求2-20中的任一项所述的方法，其中所述第二dCas蛋白未被标记。22.根据权利要求1-21中的任一项所述的方法，其中所述第一crRNA和/或第二crRNA包含与所述第一靶序列和/或第二靶序列互补的约10-40个核苷酸的序列。23.根据权利要求1-22中的任一项所述的方法，其中所述温育包含浓度为约5nM至500nM的所述DNA、第一dCas蛋白、第二dCas蛋白、第一标记的gRNA和第二标记的gRNA中的一者或多者。24.根据权利要求1-23中的任一项所述的方法，其还包括通过直接酶标记来标记所述DNA。25.根据权利要求24所述的方法，其中所述直接酶标记包括用DLE-1酶标记。26.根据权利要求1-25中的任一项所述的方法，其还包括通过切口标记来标记所述DNA。27.根据权利要求26所述的方法，其中所述切口标记包括对所述DNA进行切口，然后标记所述切口而不修复所述标记的DNA。28.根据权利要求26所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历克斯，
申请(专利权)人：生物纳米基因公司，
类型：发明
国别省市：