一种π-FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种π

【技术实现步骤摘要】
一种
π
‑
FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用


[0001]本专利技术属于核苷酸的原位单分子检测
，具体涉及一种π
‑
FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用。

技术介绍

[0002]荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization，FISH)技术是一种利用荧光标记的探针在原位上显示核酸空间信息的方法。由于其特异、高效、原位等优势，已经被广泛应用于生物学研究和临床诊断。
[0003]随着FISH技术的不断发展与优化，在复杂的细胞和组织环境中，FISH技术经常面临着信号放大能力有限、特异性低，效率低、背景噪音高的挑战，对于一些中高拷贝数靶分子的检测比较有效，对于低拷贝数的靶分子检测效果较差，虽然增加靶标探针的数目可以在一定程度上提高信号的强度，但是需要更长的核酸序列进行杂交，通常需要杂交的靶标序列在1kb左右，这极大限制了对短序列检测的应用。对于一些具有重要功能的短核酸序列RNA、短核酸序列DNA和可变剪切体(alternative splicing)，目前还没有既能产生足够强的信号，又能保证高效和低背景噪音的FISH检测方法。
[0004]此外，近年来FISH技术在临床检测中发挥重要作用。研究表明，前列腺癌是目前全球男性发病率最高的癌症，严重威胁着男性的生命健康。在临床治疗中，前列腺癌循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs)中雄激素受体剪接变体7(androgen receptor splice variant 7,ARV7)的表达与新型雄激素受体(AR)靶向治疗的先天和获得性耐药性相关。因此，ARV7可以作为一个生物标志物来监测前列腺癌治疗过程中耐药性的出现，并指导临床治疗。目前，虽然已经有一些方法尝试检测CTCs中的ARV7 mRNA的表达，如基于PCR扩增的技术和基于抗体的检测技术。但是由于雄激素受体剪切变体有多种类型，包括ARV1、ARV2、ARV4、ARV5和ARV7，不同的AR系列剪切变体序列相似性高，因此PCR扩增技术很难将ARV7与其它剪切变体区分开来，同时，当前市面上检测ARV7的抗体，特异性低，检测效果和准确性仍不明确。
[0005]有鉴于此，亟需开发出一种信号强度高、效率高、特异性强和背景噪音低的FISH技术实现灵活的对长、短核酸序列进行检测来解决上述问题。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种π
‑
FISH+核酸探针组、原位杂交方法及其应用。本专利技术设计的π
‑
FISH+核酸探针组可灵活的对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测；具有信号放大能力强、特异性强、效率高、背景噪音低、低成本等优点；同时，还可以精准检测和区分前列腺癌循环肿瘤细胞中的抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。
[0007]本专利技术的第一个目的在于提供一种π
‑
FISH+核酸探针组。
[0008]一种π
‑
FISH+核酸探针组，包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探
针和信号探针；具体原理如图1所示，其中，
[0009]所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成，形成π型结构，所述一级π型靶标探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述π脚区域的两个脚均与靶标序列互补；
[0010]所述二级探针包括3
’
端和5
’
端序列区域以及中间序列区域，所述3
’
端和5
’
端序列区域均间隔与多个三级探针互补，所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶区域互补；
[0011]所述三级探针包括3
’
端和5
’
端序列区域以及中间序列区域，所述3
’
端和5
’
端序列区域均间隔与多个四级π型探针互补，所述三级探针中间序列区域与所述二级探针3
’
端和5
’
端序列区域互补；
[0012]所述四级π型探针由左右两条探针组成，形成π型结构，所述四级π型探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述三级探针3
’
端和5
’
端序列均间隔与对应所述四级π型探针两个π脚区域互补；所述四级π型探针的π顶区域与信号探针序列互补。
[0013]进一步地，所述一级π型靶标探针的两个π脚区域碱基为16～25个，并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基；所述一级π型靶标探针π中区域的两条序列碱基为6～8个，且两条序列间有2～4个碱基互补；所述一级π型靶标探针π顶区域碱基为12～16个。
[0014]进一步地，所述四级π型探针两个π脚区域的碱基为20～22个，并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基；所述四级π型探针π中区域的两条序列的碱基为6～8个，且两条序列间有2～4个碱基互补；所述四级π型探针π顶区域的碱基为9～20个，
[0015]进一步地，所述信号探针包括信号探针A和信号探针B，所述信号探针A的5
’
端部分序列与所述四级π型探针的π顶区域互补，所述信号探针A的3
’
端部分序列与所述信号探针B的3
’
端部分序列互补；所述信号探针A和所述信号探针B的序列长度均为36～80个碱基。
[0016]更进一步地，所述信号探针A和所述信号探针B序列均标记有荧光基团，所述荧光基团选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor647、Cy3和Cy5。
[0017]在复杂的组织环境中，FISH技术经常面临着检测信号弱和背景噪音高的挑战，而且需要1kb左右核酸序列进行杂交，这极大限制了对短序列检测的应用，如对于一些具有重要功能的miRNA、短核酸序列RNA、短核酸序列DNA和序列差异较小的可变剪切体等。为了解决这一局限性，本专利技术通过如下技术原理得以实现：
[0018]本专利技术只需要一个核酸探针组便可实现对短核酸序列的检测，实现超强信号放大的同时，又具有效率高、特异性强和背景噪音低等特点，可实现对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测。一级π型靶标探针和四级π型探针与目标序列杂交，只有当π型探针对的左右两条探针的π脚区域同时结合上目标序列时，才能特异性地实现信号的放大；若单侧探针的π脚区域结合上非特异性序列，随后结合上的探针很容易被洗掉，不能形成荧光信号。因此，该π型探针的设计极大地提高了杂交效率，并降低了背景，随后通过设计的二级探针、三级探针和信号探针的杂交实现信号逐级放大。
[0019]本专利技术设计的π
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FISH+核酸探针组可灵活的对长、短核酸序列进行定性、定量和定位的检测；具有信号放大能力强、特异性强、效率高、背景噪音低、低成本等本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种π
‑
FISH+核酸探针组，其特征在于，包括一级π型靶标探针、二级探针、三级探针、四级π型探针和信号探针；其中，所述一级π型靶标探针由左右两条探针组成，形成π型结构；所述一级π型靶标探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述π脚区域的两个脚均与靶标序列互补；所述二级探针包括3
’
端和5
’
端序列区域以及中间序列区域，所述3
’
端和5
’
端序列区域均间隔与多个三级探针互补，所述二级探针的中间序列区域与所述一级π型靶标探针的π顶区域互补；所述三级探针包括3
’
端和5
’
端序列区域以及中间序列区域，所述3
’
端和5
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端序列区域均间隔与多个四级π型探针互补，所述三级探针中间序列区域与所述二级探针3
’
端和5
’
端序列区域互补；所述四级π型探针由左右两条探针组成，形成π型结构，所述四级π型探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述三级探针3
’
端和5
’
端序列区域均间隔与对应所述四级π型探针的两个π脚区域互补；所述四级π型探针的π顶区域与信号探针序列互补。2.根据权利要求1所述的π
‑
FISH+核酸探针组，其特征在于，所述一级π型靶标探针的两个π脚区域碱基为16～25个，并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基；所述一级π型靶标探针π中区域的两条序列碱基为6～8个，且两条序列间有2～4个碱基互补；所述一级π型靶标探针π顶区域碱基为12～16个。3.根据权利要求1所述的π
‑
FISH+核酸探针组，其特征在于，所述四级π型探针两个π脚区域的碱基为20～22个，并且两个π脚区域之间间隔1～2个碱基；所述四级π型探针π中区域的两条序列的碱基为6～8个，且两条序列间有2～4个碱基互补；所述四级π型探针π顶区域的碱基为9～20个。4.根据权利要求1所述的π
‑
FISH+核酸探针组，其特征在于，所述信号探针包括信号探针A和信号探针B，所述信号探针A的5
’
端部分序列与所述四级π型探针的π顶区域互补，所述信号探针A的3
’
端部分序列与所述信号探针B的3
’
端部分序列互补；所述信号探针A和所述信号探针B的序列长度均为36～80个碱基。5.根据权利要求1所述的π
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FISH+核酸探针组，其特征在于，所述信号探针A和所述信号探针B序列均标记有荧光基团，所述荧光基团选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy3和Cy5。6.权利要求1～5任一项所述的π
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FISH+核酸探针组在核酸原位检测中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述π
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FISH+核酸探针组可检测长、短核酸序列，其中短核酸序列包括短的DNA突变或者缺失、可变剪切体序列、短的RNA序列；所述核酸可选自mRNA、tRNA、rRNA、miRNA、LncRNA、ssDNA、dsDNA、cDNA、和DNA序列；所述核酸序列的长度大于16个碱基。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述可变剪切体序列为前列腺癌抗雄激素治疗耐药标志物雄激素受体剪接变体7(ARV7)。9.一种核酸原位检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～5任一项所述的π
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FISH+核酸探针组。10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括预杂交液A、预杂交液B、预杂交液C、洗脱缓冲液A、洗脱缓冲液B和洗脱缓冲液C；

【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，戴金霞，周小六，陶影峰，
申请(专利权)人：鲲羽生物科技江门有限公司，
类型：发明
国别省市：