π-FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种π

【技术实现步骤摘要】
π
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FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用


[0001]本专利技术涉及核苷酸的原位单分子检测
，具体涉及一种π
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FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用。

技术介绍

[0002]1969年，Gall和Pardue利用放射性标记的探针最早实现原位解读核酸信息(Pardue 1969)，但是这种方法有很多缺陷。首先，放射性标记探针是一种相对昂贵和危险的材料，储存和处理上都不稳定；其次，该方法背景高，自显影时间长，空间分辨率不高(Levsky and Singer 2003)。因此，这种方法很快就被基于荧光标记的技术所取代。1986年，Pinkel等人使用生物素分子或地高辛偶联的DNA探针，进而利用结合在亲和素上的报告分子或通过抗地高辛的抗体进行可视化，提高了目标核酸分子检测的速度和准确性。这种以非放射性荧光标记取代放射性同位素标记检测核酸分子的新型原位杂交方法即荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)方法得以快速发展起来。
[0003]FISH本质上是将核酸探针与细胞或组织中的目标DNA或RNA的互补序列进行杂交，通过荧光直接标记的杂交互补探针，或通过非标记的杂交互补探针结合报告分子进而借助荧光标记的检测探针或其他亲和分子，可以最终实现目标核酸的原位检测(Volpi and Bridger2008)。FISH技术的出现已经被广泛应用于临床诊断和生命科学包括神经科学、毒理学、微生物生态学、比较基因组学、细胞基因组学和染色体生物学等领域的研究，如研究DNA的复制、RNA的加工和基因的表达、物种间保守序列和物种间的染色体重排等等(Nath and Johnson 2000,Volpi et al 2008)。该项技术使得人类对染色体结构和功能的解析进入了一个新时代，开启了对空间组学探索的大门。
[0004]FISH技术中的信号呈现方法最常用的是基于半抗原形式的经典荧光原位杂交技术，其基本原理是：将带有特定标记的(如生物素、地高辛等)核苷酸单链片段作为探针，与组织切片或细胞内待测核酸片段进行杂交，在一定的条件下，形成DNA
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DNA、DNA
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RNA或RNA
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RNA双键分子，实现核酸检测的目的，但是该方法操作步骤复杂、程序繁琐、杂交信号特异性不是很高。
[0005]近年来经过不断的优化与改进，衍生出了许多不同的FISH方法，然而价格昂贵、操作繁琐、检测信号灵敏度不高、特异性不够、背景较强、杂交效率低仍是限制该技术发展的瓶颈。此外，目前的FISH对中高拷贝数的靶分子检测比较有效，对于低拷贝数甚至单拷贝靶分子的检测仍束手无策。随着单细胞技术的发展，核酸的原位检测在精度和通量上有了更高的要求，如何在单个细胞内实现单个分子精度和多个基因的同时检测是目前需要解决的棘手问题。传统的FISH由于信号放大能力有限，在单个分子检测上仍难以实现，除非设计多个荧光互补探针，但成本将大大提高。
[0006]因此，亟需开发出一种高灵敏性、高特异性、高通量、低成本的FISH技术，来实现核酸的原位、单分子、高通量检测，助力临床精准诊断和生命科学的精细化水平研究。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种π
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FISH定位单分子的探针组合物及其在核酸原位检测中的应用，该π
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FISH定位单分子的探针组合物能够有效地能够实现细胞、组织中DNA和RNA的原位、单分子定性与定量检测；该方法具有通量高、特异性好、信号放大能力强、空间分辨率高、背景噪音低、低成本、操作简单等优点，本专利技术只需要四步探针杂交就实现RNA或DNA的原位、单分子检测，在精度、通量和成本上显著优于传统荧光原位杂交方法。
[0008]为实现上述目的，本专利技术所设计一种π
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FISH定位单分子的探针组合物，所述探针组合物由四步杂交的单链DNA探针组成，分别为一级π型探针、二级探针、三级探针和信号探针；其中，
[0009]所述一级π型探针，其分别互补于靶分子区域和二级探针的中间区域，形成π型结构；所述一级π型探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述π脚区域的两个脚均与靶DNA或靶RNA序列互补；所述π中区域为两条序列，用于连接π脚区域和π顶区域，且两条序列间部分互补；所述π顶区域与二级探针的中间区域互补；
[0010]所述二级探针分为中间区域和两端区域，所述二级探针的两端区域均间隔互补有多个三级探针；且两端区域的每个互补区域均与对应三级探针的中间区域互补；
[0011]所述三级探针分为中间区域和两端区域，两端区域均间隔互补有多个信号探针。
[0012]进一步地，所述一级π型探针中，π脚区域的每个脚与靶DNA或靶RNA序列互补序列的长度为22
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25nt；
[0013]所述π顶区域与二级探针的中间区域互补的长度为12～16nt；
[0014]所述π中区域的两条序列的长度均为6
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8nt，且两条序列间有2
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5nt碱基互补(用于增加杂交效率)。
[0015]再进一步地，所述信号探针：在信号探针序列的5
’
端和3
’
端分别进行荧光修饰，使得每个信号探针都带有两个荧光基团。
[0016]再进一步地，所述荧光基团为常用的任意荧光基团；选自Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 546、Alexa Fluor 555、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 647、Cy3和Cy5；但是不仅仅局限于上述基团的修饰。
[0017]本专利技术的探针设计原理：
[0018]本专利技术只需要四步逐级放大探针杂交即可完成对核酸的原位检测，首先一级π型探针与靶序列特异性杂交，且只有当π型探针对的π脚区域同时结合靶序列时，才能特异性地形成荧光信号。若单侧π型探针的π脚结合上非特异性序列，随后结合上的二级探针很容易被洗掉，不能形成荧光信号。因此，π型探针的设计方法极大地提高了杂交效率，降低背景，保证信号的特异性。随后通过设计的二级探针、三级探针和信号探针的杂交实现信号逐级放大，其中二级探针、三级探针和信号探针特异性结合区域以及间隔区域不能与需要检测物种的核酸序列同源。设计的π型探针π脚区域要与靶序列的杂交区域要保证100％同源匹配，且不能与其它基因同源。当检测多个基因的共表达时，采取不同的探针组合物杂交即可实现，如附图1所示，只需将不同的探针组合物标记不同的荧光基团进行杂交即可；当荧光通道数目受限时，可以采取同一套探针组合物用双色、三色、或者四色荧光基团修饰去共同定位一个基因，从而提高基因检测的通量，如附图2，附图3和附图4所示。
[0019]本专利技术还提供一种上述π
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FISH定位单分子的探针组合物的制备方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种π
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FISH定位单分子的探针组合物，其特征在于：所述探针组合物由四步杂交的单链DNA探针组成，分别为一级π型探针、二级探针、三级探针和信号探针；其中，所述一级π型探针，其分别互补于靶分子区域和二级探针的中间区域，形成π型结构；所述一级π型探针包括三个区域，分别为π脚区域、π中区域和π顶区域，所述π脚区域的两个脚均与靶DNA或靶RNA序列互补；所述π中区域为两条序列，用于连接π脚区域和π顶区域，且两条序列间部分互补；所述π顶区域与二级探针的中间区域互补；所述二级探针分为中间区域和两端区域，所述二级探针的两端区域均间隔互补有多个三级探针；且两端区域的每个互补区域均与对应三级探针的中间区域互补；所述三级探针分为中间区域和两端区域，两端区域均间隔互补有多个信号探针。2.根据权利要求1所述π
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FISH定位单分子的探针组合物，其特征在于：所述一级π型探针中，π脚区域的每个脚与靶DNA或靶RNA序列互补序列的长度为22
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25nt；所述π顶区域与二级探针的中间区域互补的长度为12～16nt；所述π中区域的两条序列的长度均为6
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8nt，且两条序列间有2
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5nt碱基互补。3.根据权利要求1所述π
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FISH定位单分子的探针组合物，其特征在于：所述信号探针：在信号探针序列的5
’
端和3
’
端分别进行荧光修饰，使得每个信号探针都带有两个荧光基团。4.根据权利要求1所述π
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FISH定位单分子的探针组合物，其特征在于：所述荧光基团为常用的任意荧光基团；...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹罡，戴金霞，陶影峰，周小六，林达，徐伟泽，
申请(专利权)人：鲲羽生物科技江门有限公司，
类型：发明
国别省市：