一种基于序列设计的无细胞体系线形模板降解抑制方法技术

本发明专利技术属于合成生物学蛋白表达模板设计领域，具体提供了一种基于序列设计的用于大肠杆菌无细胞基因表达体系线形基因模板降解抑制的方法：向线形基因模板的端部添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列来抑制线形基因模板在无细胞基因表达体系内的降解；本发明专利技术的方法能够有效提高基于线形基因模板的无细胞基因表达体系的蛋白表达量，推动基于线形基因模板的无细胞基因表达体系的发展，扩大无细胞基因表达体系的应用范围。细胞基因表达体系的应用范围。细胞基因表达体系的应用范围。

【技术实现步骤摘要】
一种基于序列设计的无细胞体系线形模板降解抑制方法


[0001]本专利技术属于合成生物学蛋白表达模板设计领域，具体涉及一种用于无细胞蛋白质表达模板设计的方法。

技术介绍

[0002]无细胞基因表达在生命科学中用作基础研究工具已有五十多年的历史。但数十年来一些关键因素限制了其在工程应用上的潜力：蛋白质产量低且不稳定，反应时间不足，试剂成本较高，反应规模小，无法正确折叠复杂蛋白质和蛋白质组件，转录限于内源性细胞RNA聚合酶。近年来，技术的发展已经开始系统地解决这些局限性，从而使得无细胞基因表达能够在新兴的合成生物学领域中得到广泛的应用。近年来，以线形DNA为模板的无细胞基因表达逐渐受到人们的关注。无细胞基因表达体系通常采用环形质粒DNA作为模板。与环形质粒DNA相比，线形DNA的构建更为简单。环形质粒DNA的克隆通常是将目标质粒化转入感受态细胞内，而后通过细胞克隆，从细胞中提取出大量的目标质粒。而线形DNA的获取只需通过聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增得到复数的线形DNA，简化了克隆步骤，进一步缩短了实验周期，提高了实验效率。以线形DNA为模板的无细胞基因表达也因此得到了更为广泛的应用。
[0003]目前，以线形DNA为模板的无细胞基因表达仍存在一些问题，阻碍了其进一步的发展。其中主要的一个问题就是以线形DNA为模板的无细胞基因表达蛋白质的表达量远低于以环形质粒DNA为模板的无细胞基因表达。造成这种差异的主要原因是线形DNA易被无细胞基因表达体系中细胞提取物中的DNA酶降解。在相关的DNA酶中，RecBCD酶被认为是主要降解线形DNA的核酸外切酶。基于这一点，目前的研究主要集中在抑制RecBCD酶的活性上。为抑制RecBCD酶的活性，前人的尝试包括利用GamS蛋白抑制RecBCD酶的活性；筛选合适的小分子抑制剂抑制RecBCD酶的活性；将线形DNA与材料结合抑制线形DNA降解。但目前的研究仅局限于添加外源的抑制剂或者保护剂来提高线形DNA在无细胞基因表达体系内的稳定性，并且目前的稳定效果均有限。此外，这种添加外源的抑制剂或者保护剂的方式操作复杂，成本较高，缺乏足够的灵活性，且会对无细胞基因表达体系本身产生一定的扰动。
[0004]尽管已经有研究基于无细胞基因表达体系内线形DNA的降解问题给出了一定的解决方法。但目前的抑制效果仍十分有限，且缺乏足够的灵活性，不能满足无细胞基因表达体系对蛋白质合成的要求。因此需要开发一种更加简便且有效的无细胞基因表达体系线形DNA模板的降解抑制方法。而序列设计在线形DNA降解抑制中的重要作用仍未被挖掘。通过序列设计的方式提高线形DNA在无细胞基因表达体系内的稳定性为线形表达模板的降解问题提供了一种简便可行的解决方案，不仅成本低廉，设计灵活，并且拥有广阔的研究前景。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题：
[0006]一方面：本申请提供了一种基于序列设计的用于大肠杆菌无细胞基因表达体系线
形基因模板降解抑制的方法，其特征在于：向其中线形基因模板的端部添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列来抑制线形基因模板在无细胞基因表达体系内的降解。
[0007]进一步地，向线形基因模板的两端添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列
[0008]进一步地，所述无细胞基因表达体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。
[0009]进一步地，所述线形基因模板为线形DNA，其获得方式为以质粒模板进行PCR。
[0010]进一步地，所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列GC含量为60
‑
65％，优选为选自SEQ ID NO.1
‑
6的序列。
[0011]进一步地，所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列长度为5
‑
40个碱基对。
[0012]另一方面，本申请提供了一种基于序列设计的，通过大肠杆菌无细胞基因表达体系线形基因模板降解抑制，从而提高以线形DNA为模板的无细胞基因表达体系的蛋白质表达量的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0013]利用PCR技术，通过引物设计的方式在线形基因模板两端加上富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列；将获得的修饰后的线形基因模板加入无细胞基因表达体系进行无细胞蛋白表达反应。
[0014]进一步地，所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列GC含量为60
‑
65％，优选为选自SEQ ID NO.1
‑
6的序列。
[0015]进一步地，所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列长度为5
‑
40个碱基对。
[0016]进一步地，所述无细胞蛋白表达反应中为15
‑
37℃。
[0017]进一步地，所述无细胞蛋白表达反应时间为0.1
‑
24h。
[0018]进一步地，所述无细胞蛋白表达反应可添加优选GamS的DNA酶抑制剂，用以增强线形基因模板降解抑制效果，实现协同作用。
[0019]另一方面，本申请提供了上述方法在无细胞体系基因电路设计，附加值生物产物的生产以及人工细胞方面的应用。
[0020]有益效果：
[0021]本申请中的上述富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列可以应用于大肠杆菌无细胞基因表达体系中线形基因模板的制备，相比不含保护序列的线形基因模板，添加保护序列抑制了线形基因模板的降解。本方法实现的无细胞基因表达体系内线形基因模板的降解抑制能够有效提高基于线形基因模板的无细胞基因表达体系的蛋白表达量。从而推动基于线形基因模板的无细胞基因表达体系的发展，扩大无细胞基因表达体系的应用范围。使其能够更好地应用在生物芯片构建、人工细胞合成等领域。
附图说明
[0022]图1为不同保护序列的对蛋白表达量的影响结果图；
[0023]图2为基于修饰后的线形基因模板原型电路元件设计图；
[0024]图3为基于修饰后的线形基因模板的生物芯片设计图；
[0025]图4为基于保护序列修饰的线形基因模板用于大肠杆菌无细胞蛋白质合成的方法
的合成流程图。
具体实施方式
[0026]本方法利用添加保护序列的方式提高线形基因模板在无细胞基因表达体系内的稳定性。这一成果可以应用在以线形DNA为模板的各类无细胞体系中：
[0027]实施例1
[0028]保护序列的设计：
[0029]针对上述以线形DNA为模板的无细胞基因表达研究中遇到的困难。我们希望将目光聚焦在线形DNA序列设计上，通过计算机模拟的方式实现对不同设计方案的筛选，最终筛选出与降解酶结合稳定性最弱的序列，提高线形DNA稳定性，实现线形DNA在无细胞基因表达体系中的蛋白表达量的提高。
[0030]我们从线形DNA端部的GC含量入手，设计不同的GC含量和GC分布，筛选出针对线形DNA降解抑制最优的线形DNA序列，提高线形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于序列设计的用于大肠杆菌无细胞基因表达体系线形基因模板降解抑制的方法，其特征在于：向其中线形基因模板的端部添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列来抑制线形基因模板在无细胞基因表达体系内的降解。2.根据权利要求1所述的方法，其中向线形基因模板的两端添加规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述无细胞基因表达体系为基于大肠杆菌细胞提取物的无细胞体系。4.根据权利要求1
‑
3任一项所述的方法，其中所述线形基因模板为线形DNA，其获得方式为以质粒模板进行PCR。5.根据权利要求1
‑
4任一项所述的方法，其中所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列GC含量为60
‑
65％，优选为选自SEQ ID NO.1
‑
6的序列。6.根据权利要求1
‑
5任一项所述的方法，其中所述规律的富含鸟嘌呤、胞嘧啶碱基对的保护序列长度为5
‑
40个碱基对。7.一种基于序列设计的，通过大肠杆菌无细胞基因表达体系线形基因模板降解抑制，从而提高以线形DNA为模板的无细胞基因表达体系的蛋白质表达量的方法，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢元，陈鑫杰，
申请(专利权)人：清华大学，
类型：发明
国别省市：