检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。本发明专利技术所述的检测探针包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述连接段的序列长度为5

【技术实现步骤摘要】
检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法


[0001]本专利技术属于固态纳米孔传感器检测领域，特别涉及一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。

技术介绍

[0002]端粒是一段具有重复序列(TTAGGG)的DNA序列，通常存在于细胞染色体的末端。在细胞分裂过程中，染色体的复制会导致端粒的不断缩短。而端粒酶作为体内广泛存在的一种逆转录酶，在维持端粒长度以及细胞生长、分化过程中起到非常关键的作用。端粒酶通过在端粒的3
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端不断的复制TTAGGG的重复序列达到维持端粒长度以及细胞活性的目的。2009年，ELIZABETN等发现了端粒酶以及端粒对于细胞活性的保护机制而获得了诺贝尔医学奖。此后，许多研究表明端粒酶的活性过高可能会诱导细胞的永久性存活，甚至引发癌症。但是，端粒酶活性过低又会加速细胞衰老，甚至凋亡。在正常人的体细胞中，端粒酶处于抑制的状态，研究发现在包括胃癌、乳腺癌、宫颈癌、结肠癌等大多数癌症细胞中，端粒酶的活性明显高于正常水平。因此，端粒酶活性检测在癌症的诊疗等方面具有重大的研究意义。WEINBERG等发现，对于端粒酶的抑制可能会导致细胞的死亡。不仅如此，越来越多的研究者发现端粒酶可以作为重要的靶点在癌症的诊断，治疗方面发挥作用。因此，如何准确、灵敏、快速地获得端粒酶活性成为了在临床诊断和治疗方面的一大热点。
[0003]目前应用最广最为经典的方法是基于链式聚合反应的端粒酶重复序列扩增技术(PCR
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TRAPs)。该方法将端粒延伸方法和聚合酶链式反应相结合，首先需要端粒酶在端粒底物的3
’
端不断的复制TTAGGG的重复序列，然后用与端粒重复序列互补的反向引物进行PCR扩增，然后利用电泳分离产物。该方法具有一定的灵敏度，但依赖于PCR扩增反应，操作繁琐，同时容易受到来自细胞内的其他物质的干扰，造成检测结果不准确，因此该方法也不适用于端粒酶有关药物的筛选。所以，提供一个简单直接的端粒酶单分子检测方案，来实现端粒酶活性的高灵敏检测具有十分重要的研究意义。同时，现今的研究中很难提供一个可以表征端粒酶延伸序列的动力学过程的实时检测过程，这对于研究细胞的生长与凋亡以及癌症，肿瘤的诊疗也具有十分重要的研究价值。
[0004]纳米孔传感器作为一种单分子检测工具，具有高通量、无需标记等特征，在近几十年来得到了广泛研究。该技术最早用于DNA测序，在DNA传输过程中每个碱基通过一个纳米级通道(纳米孔)时产生不同的离子脉冲信号，可以区分不同的核苷酸。固态纳米孔通常存在于固态薄膜上，分离出含有导电电解质的两个腔室，电极浸在每个腔室里。当施加一定的偏置电压在电极上，由此产生的电场使溶液中的电解质离子定向运动穿过孔隙，形成离子电流信号。当溶液中的生物分子进入纳米孔，当孔隙被堵塞时，离子电流会产生波动，形成一系列的阻塞电流信号。当分子穿过通道，离子电流回到基线电流。通过分析阻塞信号的幅值和持续时间，可以确定目标分子的物理和化学性质。在测序中，每一个核苷酸都以不同的方式阻断通道，从而产生不同的振幅和持续时间，这些信息再转化为DNA序列信息。除DNA测序外，纳米孔的无需标记、无需放大的单分子检测技术还可以在RNA检测、蛋白质检测等各
种重大疾病的生物标志物检测方面得到应用。该技术具有的无标记、高通量、低的材料需求的显著优势，并且不会受PCR所引入的扩增偏差的影响，对生物信息进行直接读取，大大简化了实验过程，减少误差，因此非常适用于体内超低水平生物靶分子的检测以及疾病有关的药物的筛选，在临床诊疗具有很大的应用潜力。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：本专利技术提供了一种检测探针、试剂盒及端粒酶活性的直接检测方法。本专利技术使用金纳米颗粒通过Au
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S键连接端粒酶引物作为探针，通过固态纳米孔传感器研究端粒酶活性与延伸的动力学过程，实现端粒酶活性的直接检测。
[0006]技术方案：本专利技术所述的一种检测探针，包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述连接段的序列长度为5
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8nt；所述引物段的长度为15
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20nt。
[0007]优选地，所述连接段通过Au
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S键连接在金纳米颗粒表面。
[0008]优选地，所述引物段序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]优选地，所述金纳米颗粒的直径为5
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10nm。
[0010]优选地，所述金纳米颗粒的直径为5nm，选用的金纳米颗粒均一稳定，其大小尺寸在纳米孔传感器形成高信噪比的易位信号，同时相对于单一的DNA链，可以极大地降低DNA在易位过程中的速度，提高检测的灵敏度。
[0011]本专利技术的检测探针使用金纳米颗粒作为载体，通过Au
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S键将端粒DNA序列连接到金纳米颗粒表面，DNA序列提高了金纳米颗粒的分散性和稳定性，同时纳米颗粒提供表面载体，富集了反应物，降低了DNA分子的易位速度。
[0012]所述连接段为polyT序列。
[0013]本专利技术还提供了上述的检测探针在制备用于检测端粒酶活性的试剂盒中的应用。
[0014]优选地，本专利技术提供了一种用于固态纳米孔中的可实时检测端粒酶活性的检测探针，所述检测探针包括：包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述金纳米颗粒的直径为5nm；所述探针序列的引物段序列如SEQ ID NO.1所示；或者所述探针序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针序列通过Au
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S键连接在金纳米颗粒表面；在金纳米颗粒和引物序列段之间还有一段柔性片段。优选地，柔性片段的长度为5
‑
8nt。
[0015]本专利技术的原理为：探针序列(包括端粒DNA链)通过Au
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S键连接到金纳米颗粒表面，并在端粒酶的活性反应中，生长为不同的长度的端粒序列，包覆在金纳米颗粒表面，作为检测探针，该检测探针可以实时检测端粒酶活性。当检测探针与端粒酶经过不同时间反应后，得到金球
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DNA复合产物(金球
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DNA复合产物，指酶活性反应后，表面覆盖不同长度的DNA序列的金纳米球)表面标记不同长度的DNA链，会引起过孔颗粒的电荷、体积以及扩散速度等发生改变，从而起易位过程中阻塞电流信号不同，并可以基于不同的阻塞电流信号来区分DNA链长度的变化，得到端粒酶活性。
[0016]本专利技术还提供了上述的检测探针在纳米孔传感器检测中的应用。
[0017]本专利技术所述的检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0018](S1)取金纳米颗粒溶液，加入TBE溶液与巯基修饰的端粒酶引物序列；
[0019](S2)将步骤(S1)得到的产物加盐老化；
[0020](S3)将步骤(S2)老化后的DNA修饰金纳米颗粒离心，保留沉淀，得到DNA
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金球复合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测探针，其特征在于，包括金纳米颗粒以及与金纳米颗粒连接的探针序列，所述探针序列包括连接段以及用于端粒酶识别的引物段；所述连接段的序列长度为5
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8nt；所述引物段的长度为15
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20nt。2.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述连接段通过Au
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S键连接在金纳米颗粒表面。3.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述引物段序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述金纳米颗粒的直径为5
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10nm。5.根据权利要求1所述的检测探针，其特征在于，所述连接段为polyT序列。6.一种如权利要求1
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5任一所述的检测探针在制备用于检测端粒酶活性的试剂盒中的应用。7.根据权利要求1
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5任一所述的检测探针在纳米孔传感器检测中的应用。8.一种如权利要求1
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【专利技术属性】
技术研发人员：武灵芝，叶媛，翁丽星，鲍碧清，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：