一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN及其制备方法和应用。本发明专利技术所述SLMN组成中包括DNA四面体、LD链与n种MB，其中，MB装载在LD链上，DNA四面体与装载MB的LD链杂交，n为≥3的自然数。该SLMN对端粒酶具有良好的选择性，可以更加灵敏的检测活细胞中或细胞提取物中端粒酶的活性，可以区分不同种类癌细胞中端粒酶活性的差异，并且对细胞毒性极低，可用于端粒酶活性检测、及对端粒酶对底物作用的实时监测以及对端粒酶原位产物长度分布的测定。测定。测定。

【技术实现步骤摘要】
一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及端粒酶活性检测
，具体涉及一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]人端粒酶由端粒酶逆转录酶和端粒酶RNA模板组成，是一种核糖核蛋白，可催化端粒酶重复序列(TAAGGG)n添加到端粒末端(S.B.Cohen,M.E.Graham,G.O.Lovrecz,N.Bache,P.J.Robinson,R.R.Reddel,Science,2007,315,1850)。它能够维持端粒的长度，否则端粒的长度会在细胞分裂过程中缩短，也能导致细胞的无限增殖(M.A.Blasco,Nat.Rev.Genet.,2005,6,611.)。研究发现端粒酶活性在大多数类型的恶性癌细胞中过表达，但在正常的体细胞中没有过表达，这说明了癌细胞的永生性(C.B.Harley,Nat.Rev.Cancer,2008,8,167.)。抑制端粒酶活性使端粒长度不能维持，从而抑制了细胞的连续增殖(A.P.Cunningham,W.K.Love,R.W.Zhang,L.G.Andrews,T.O.Tollefsbol,Curr.Med.Chem.,2006,13,2875.)。因此，端粒酶被认为是有前景的癌症生物标志物，检测端粒酶对于更好地了解其在癌症中的作用以及进一步开发新的癌症诊断和治疗方法至关重要(L.
‑
J.Wang,F.Ma,B.Tang,C.
‑
Y.Zhang,Chem.Sci.,2017,8,2495.)。
[0004]建立的用于端粒酶活性检测的方法包括基于凝胶的端粒重复扩增方案(TRAP)、比色法、电化学法、化学发光法、表面增强拉曼散射和荧光测量法等。这些检测通常用细胞提取物中的端粒酶进行。最近，已经出现了几种基于DNA功能化纳米材料、DNA级联扩增、聚集诱导发射(AIE)等的原位方法来直接检测活细胞中的端粒酶活性。例如，Ju课题组设计了DNA包裹的，含有染料的介孔二氧化硅纳米颗粒，通过胞内端粒酶延伸，DNA与纳米颗粒分离，从而释放出染料并恢复荧光。Zhang课题组将多组分信号放大基序递送到细胞中，端粒酶可以触发DNAzyme裂解和催化发夹组装的级联扩增。Xia课题组开发了一种基于AIE发光素的生物探针，该探针含有端粒酶底物，转染的AIEgens可以结合端粒酶延伸的端粒重复序列，聚集使荧光增强。然而，这些方法主要基于对整个产物的响应，提供细胞内端粒酶活性的信息。而端粒酶的特征是它可以易位，重复利用RNA模板进行DNA合成，依次添加端粒重复序列(M.A.Rivera,E.H.J.Blackburn,Biol.Chem.,2004,279,53770.)。添加一个重复单元后，端粒酶要么从底物DNA解离，要么沿着新合成的链易位以进一步延伸(X.Zhou,D.Xing,Chem.Soc.Rev.,2012,41,4643.)，从而产生各种长度的产物(X.Ren,H.Li,R.W.Clarke,D.A.Alves,L.Ying,D.Klenerman,S.Balasubramanian,J.Am.Chem.Soc.,2006,128,4992.)。端粒酶的协同作用揭示了其催化机制(E.M.Patrick,J.D.Slivka,B.Payne,M.J.Comstock,J.C.Schmidt,Nat.Chem.Biol.,2020,16,801.)，而产物的长度分布与端粒
酶的个体差异(如突变)密切相关(S.Shastry,O.Steinberg
‑
Neifach,N.Lue,M.D.Stone,Nucleic Acid.Res.,2018,46,3088.)。然而，迄今为止，这种原位表征仍然是一个挑战。

技术实现思路

[0005]为了改进现有技术的不足，本专利技术提供了一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN，其对端粒酶具有良好的选择性，可以更加灵敏的检测活细胞中或细胞提取物中端粒酶的活性，可以区分不同种类癌细胞中端粒酶活性的差异，并且对细胞毒性极低，本专利技术还提供了SLMN的制备方法和SLMN在端粒酶活性检测、在对端粒酶对底物作用的实时监测以及对端粒酶原位产物长度分布的测定中的应用。
[0006]在本专利技术中，专利技术人将四种类型的DNA链退火以形成DNA四面体，从其中一个顶点延伸出短的单链结构域，然后与另一条长DNA(LD)链杂交，该链包括与四面体顶点上的延伸域互补的锚定域，一个可以装载多个分子信标(MBs)的支持域和一个端粒酶底物(TS)域。
[0007]DNA四面体，LD链与多种分子信标(MB)共同组成DNA四面体探针。多种MB上标记了不同的荧光团和淬灭团，荧光团因与淬灭团接近而被淬灭。由于MBs中茎结构域和LD链中的碱基互补配对，从而依次组装到LD链的支持域上。
[0008]在端粒酶的作用下，端粒酶引物延伸添加端粒重复序列。当添加一个重复单元时，由于产物长度的限制和序列的互补性，它可以与最近的分子信标杂交以恢复该分子信标的荧光，但不能进一步杂交。当添加两个重复单元时，它们可以与最近的两个分子信标杂交，恢复两种不同发射波长的荧光。当添加三个或更多重复单元时，三种分子信标都被打开，三种荧光团依次点亮。一种特殊的设计是在MB的环部添加一些辅助碱基，并且MB的打开将使辅助碱基与新合成的端粒重复序列配合，共同打开下一个MB。组装在四面体上的每个分子信标都可以被视为发出独特颜色的纳米灯泡，可以随端粒重复序列的产生而依次点亮。由于DNA四面体载体的高细胞内化效率，良好的生物相容性，结构稳定性和可控性，所构建的纳米探针可以被活细胞摄取并响应细胞内端粒酶活性。因此，解析该信号可以揭示具有特定端粒重复单元的延伸产物的贡献，而不是获得整个产物的混合信号。本专利技术不仅可以检测细胞内端粒酶活性，而且可以实现对端粒酶对底物作用的实时监测以及原位产物长度分布的测定。
[0009]具体地，本专利技术的技术方案如下所示：
[0010]在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN(下文中均简称为SLMN)，其组成中包括DNA四面体、长DNA链(下文中简称LD链)与n种分子信标(分子信标在下文中简称为MB，表示复数时可简称为MBs)，其中，MB装载在LD链上，DNA四面体与装载MB的LD链杂交；n为≥3的自然数。
[0011]在本专利技术的一些实施方式中，所述分子信标有三种，分别为MB1、MB2和MB3。
[0012]其中，DNA四面体的顶点具有延伸域，该延伸域为由DNA四面体的其中一个顶点延伸出的单链结构域。
[0013]LD链包括锚定域、支持域和端粒酶底物(TS)域；其中，锚定域与DNA四面体顶点上的延伸域互补，支持域装载MB。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN，其组成中包括DNA四面体、LD链与n种MB，其中，MB装载在LD链上，DNA四面体与装载MB的LD链杂交，n为≥3的自然数。2.根据权利要求1所述的顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN，其特征在于，DNA四面体的顶点具有延伸域，其为由DNA四面体的其中一个顶点延伸出的单链结构域；LD链包括锚定域、支持域和TS域；其中，锚定域与DNA四面体顶点上的延伸域互补，支持域装载MB；MB通过其上的茎结构域与LD链中的支持域特异性杂交从而依次组装到LD链上。3.根据权利要求1所述的顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN，其特征在于，不同的MB标记不同的荧光团和淬灭剂；优选地，MB的环部具有辅助碱基。4.权利要求1至3中任一项所述的顺序点亮多色DNA四面体纳米探针SLMN的制备方法，其包括：将DNA四面体和负载MB的LD链共同孵育，组装得到SLMN。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将LD链和n个MB在PBS缓冲液中混合；将该混合物加热后保持，然后逐渐冷却至室温，得到负载MB的LD链。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐晓文，张芮源，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：