核酸分子的测序方法技术

本发明专利技术提供一种核酸分子的测序方法。本发明专利技术在测序的过程中，基于两组核苷酸的特定标识，针对测序模板同一待测位点，通过形成五元络合物的形式在待测位点引入第一组核苷酸中具有预设标识的核苷酸，获得第一标识信息，然而再在同一位点以共价延伸的形式引入第二组核苷酸中具有预设标识的核苷酸，获得第二标识信息，将第一标识信息、第二标识信息采用二进制进行双重确认，提高碱基识别的准确率。本发明专利技术的测序方法，基于两组核苷酸的预设标识进行识别，能够通过简单的单激发光源和单色光路系统硬件测序仪器实现，成本低。成本低。成本低。

【技术实现步骤摘要】
核酸分子的测序方法


[0001]本专利技术涉及基因测序
，特别涉及一种核酸分子的测序方法。

技术介绍

[0002]作为基因组学研究的关键技术之一——基因测序技术，在过去的40多年里迅速发展。1977年两次诺贝尔奖得主Sanger专利技术双脱氧链终止法(Sanger测序法，即第一代测序技术)，其后出现第一代基因测序仪ABI3700，并于2003年完成了人类基因组计划测序长度达30亿个碱基对的测序。然而，第一代测序技术在通量、成本、读长、测序速度和数据分析系统等方面都不能满足日益增长的全基因组测序需求，因此出现了下一代测序(next generation sequencing，NGS)技术。
[0003]NGS技术又称大规模平行测序或深度测序，包括第二代、第三代和第四代测序技术。目前，具代表性的第二代测序平台有瑞士Roche公司的454，美国Illumina公司的基因组测序仪(genome analyzer，GA)、HiSeq 2000和MiSeq，美国ABI公司的寡聚物连接检测测序(sequencing by oligo ligat本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸分子的测序方法，其特征在于，所述测序方法包括如下步骤：提供第一组核苷酸，所述第一组核苷酸中与所述测序模板待测位点配对的核苷酸、所述测序模板、测序引物、第一核酸聚合酶和非催化竞争金属离子反应形成非共价五元络合物；所述第一组核苷酸包括第一dATP或其类似物、第一dTTP或其类似物、第一dCTP或其类似物和第一dGTP或其类似物，且每种核苷酸或其类似物各自独立地具有预设标识；检测所述非共价五元络合物中对应含有的预设标识，获取第一标识信息；将所述非共价五元络合物打散，保留所述测序模板和所述测序引物，用于与第二组核苷酸、第二核酸聚合酶和催化竞争金属离子进行共价延伸；所述第二组核苷酸包括第二dATP或其类似物、第二dTTP或其类似物、第二dCTP或其类似物和第二dGTP或其类似物，且每种核苷酸或其类似物具有可逆终止子结构并各自独立地具有预设标识；检测共价延伸所得产物中对应含有的预设标识，获取第二标识信息；将所述第一标识信息和第二标识信息以二进制组合，根据所得组合信息明确所述配对核苷酸的种类，从而确定待测位点的核苷酸的种类；其中，所述第一组核苷酸和所述第二组核苷酸满足的条件包括如下定义的组合标识1、组合标识2、组合标识3和组合标识4彼此不同，组合标识1为所述第一组核苷酸中第一dATP或其类似物的预设标识和所述第二组核苷酸中第二dATP或其类似物的预设标识；组合标识2为所述第一组核苷酸中第一dTTP或其类似物的预设标识和所述第二组核苷酸中第二dTTP或其类似物的预设标识；组合标识3为所述第一组核苷酸中第一dCTP或其类似物的预设标识和所述第二组核苷酸中第二dCTP或其类似物的预设标识；组合标识4为所述第一组核苷酸中第一dGTP或其类似物的预设标识和所述第二组核苷酸中第二dGTP或其类似物的预设标识。2.根据权利要求1所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述预设标识包括标记和非标记；可选地，所述标记包括荧光标记、化学发光标记、生物发光标记、电化学发光标记、电信号标记和磁信号中的一种或者多种；进一步可选地，所述荧光标记选自AF532、ATTO532、Cy3B、Cy3、Cy5、ATTO647N、ATTO647和AF647中的一种或者多种。3.根据权利要求2所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述预设标识为标记，所述标识信息记作1，所述预设标识为非标记，所述标识信息记作0，以1和0进行二进制组合。4.根据权利要求2所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述第二组核苷中的第二dATP或其类似物或/和第二dGTP或其类似物的预设标识为标记。5.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述非催化竞争金属离子选自钙离子、锶离子和钡离子中的一种或者多种。6.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述催化竞争金属离子为镁离子。7.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述可逆终
止子结构选自3
’‑
苄基叠氮、3
’‑
R
‑
SS
‑
和3
’‑
NH2‑
O
‑
中的一个。8.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，所述第一核酸聚合酶和所述第二核酸聚合酶各自独立地选自Taq DNA聚合酶、KOD DNA聚合酶、9
°
N DNA聚合酶和Klenow酶中一种。9.根据权利要求1至4中任一项所述的核酸分子的测序方法，其特征在于，打散所述非共价五元络合物的试剂包含络合所述非催化竞争金属离子的配体；可选地，所述配体选自EDTA、EGTA、NTA和HPTA中的一种或者多种；进一步可选地，打散所述非共价五元络合物的试剂包含硫氰酸胍、柠檬酸钠、和EDTA；更进一步可选地，打散所述非共价五元络合物的试剂包含水以及3...

【专利技术属性】
技术研发人员：李汉东，成昌梅，肖育劲，刘金枝，邹艳，吴高椿，丁利杰，黄岩，张朝文，高群，
申请(专利权)人：珠海市大道测序生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：