一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法以及胰岛β细胞技术

本申请涉及胰岛细胞分化的技术领域，具体公开了一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法以及胰岛β细胞。该方法包括步骤：A1、传代培养；A2、细胞分化：将人间充质干细胞在诱导分化培养液中培养5

【技术实现步骤摘要】
一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛
β
细胞的方法以及胰岛
β
细胞


[0001]本申请涉及胰岛细胞分化的
，更具体地说，它涉及一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法以及胰岛β细胞。

技术介绍

[0002]糖尿病是继心血管疾病和癌症之后的第三大高发慢性疾病，它严重危害着人类的生命健康。目前，糖尿病的治疗方法包括：如口服降糖药物，如注射外源性胰岛素等，这些方法都不能从根本上解决问题。器官移植是一种比较好的解决方法，但由于受体供体不足和免疫排斥问题限制了其应用。而干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应相对较低，因此干细胞替代疗法是一种理想的解决免疫排斥的方式。其中，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)不仅可在体外自我复制、扩增15代以上，还可在体外被诱导分化为分泌胰岛素的β细胞，提供无限量的胰岛β细胞来源。成人的MSC可来源于自体脂肪和骨髓抽取，通过简单的贴壁培养即可获取MSC，糖尿病患者移植自体MSC诱导而成的胰岛细胞不会发生排斥反应。
[0003]公布号为CN 112094800 A的申请文件中以干细胞分化获得胰岛β细胞的方法为：取传代培养后的间充质干细胞在培养基A上培养1
‑
2天，随后于培养B中培养7
‑
8天，最后于培养C中培养12
‑
15天，最后得到胰岛细胞。其中，培养基A为含有10％的胎牛血清的DMEM/F12培养基；培养基B以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加有白藜芦醇、全反式维甲酸、尼克酰胺、五肽胃泌素、L
‑
谷氨酰胺、血小板源性生长因子、谷氨酰胺成纤维细胞生长因子以及胰高血糖素样肽I；培养基C以DMEM/F12培养基为基础培养基，并添加有白藜芦醇、全反式维甲酸、尼克酰胺、谷氨酰胺、血小板源性生长因子、谷氨酰胺成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子和激活素A。
[0004]上述方法虽然能够获得胰岛素和C
‑
肽分泌量较高的胰岛β细胞，但是其分化阶段的培养周期为20
‑
25天，时间周期较长。

技术实现思路

[0005]为了减少制备周期并保证较高的胰岛素和C
‑
肽分泌量，本申请提供一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法以及胰岛β细胞。
[0006]第一方面，本申请提供一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法，采用如下的技术方案：一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法，包括以下步骤：A1、传代培养：将人脂肪间充质干细胞体外培养3
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5代，至细胞密度为80
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90％时消化、富集细胞，得到人间充质干细胞；A2、细胞分化：所述人间充质干细胞在诱导分化培养液中培养5
‑
7天，得到胰腺内胚层细胞球，随后加入补充添加物继续培养7
‑
12天，得到分化成熟的胰岛β细胞；
所述诱导分化培养液包括以下组分：DMEM/F12培养液、40
‑
50ng/ml激活素A、0.5
‑
0.7wt％的N2补充物、0.5
‑
0.7wt％的B27补充物、0.4
‑
0.6wt％的胎牛血清、1.5
‑
2.5μM维甲酸、45
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55ng/ml角质细胞生长因子、5
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10ng/ml PDX1人重组蛋白和15
‑
25ng/ml NKX2.2人重组蛋白；以所述诱导分化培养液为参考，所述补充添加物包括以下组分：35
‑
65ng/ml肝细胞生长因子、6
‑
10mM烟酰胺、80
‑
120μM 3
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异丁基
‑1‑
甲级黄嘌呤和40
‑
60ng/ml表皮生长因子。
[0007]本申请中各物质的添加量均是以该物质在诱导分化培养液内的配制终浓度表示的。
[0008]通过采用上述技术方案，通过首先以诱导分化培养液内先培养一段时间，再加入补充添加物的方式进行脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的培养；该方法中，仅仅通过两步培养(诱导分化培养+补充添加物培养)即获得胰岛β细胞，其分化阶段的培养周期仅仅为12
‑
18天，培养时间缩短了近一周。
[0009]而该培养方法中，其诱导培养液中添加的组分包括DMEM/F12培养液、激活素A、N2补充物、B27补充物、胎牛血清、维甲酸、角质细胞生长因子、PDX1人重组蛋白和NKX2.2人重组蛋白。其中，N2补充物和B27补充物是一种血清替代物，在胎牛血清用量较少的情况下以这两种物质补充胎牛血清用量过少带来的效果损失。维甲酸是体内维生素A的代谢中间产物，具有促进上皮细胞增生、分化和角质溶解等代谢作用；角质细胞生长因子(KGF
‑
2)是人体皮下组织细胞分泌的一种碱性蛋白生长因子，能特异刺激上皮细胞的新陈代谢等生理过程，包括细胞的再生、分化和迁移等。PDX1基因又称为胰岛素启动子，是β细胞开始形成和发育成熟的标志基因，PDX1基因表达与否决定胰岛素分泌细胞诱导分化是否成功。此外，Nkx2.2基因的表达对于β细胞的形成也是必不可少的一个基因。本申请发现，通过在诱导分化培养液内添加PDX1基因和Nkx2.2基因的表达产物：PDX1人重组蛋白和NKX2.2人重组蛋白，能够显著提高胰岛β细胞的胰岛素和C
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肽的分泌量。有可能的是，NKX2.2人重组蛋白的添加能够促进形成胰岛β细胞，并调控下游基因，例如NKX6.1基因的表达；而形成的胰岛β细胞，进一步在PDX1人重组蛋白的调控下逐渐生成前体细胞，并逐渐成熟，得到具有胰岛素和C
‑
肽高分泌能力的胰岛β细胞。此外，这两种重组蛋白的添加，有可能会影响其他基因(例如Pax6基因)的表达，使得胰岛α、γ等非目标胰岛细胞的分化，从而保证得到的胰岛β细胞纯度较高。
[0010]本申请通过PDX1人重组蛋白、NKX2.2人重组蛋白共同发挥刺激脂肪间充质干细胞定向分化为胰岛β细胞，并通过维甲酸、KGF
‑
2二者的协同作用进一步辅助刺激胰岛β细胞的胰岛素和C
‑
肽的分泌行为。最终，在短周期内得到较高分泌胰岛素和C
‑
肽的胰岛β细胞。这里需要注意的是，PDX1人重组蛋白、NKX2.2人重组蛋白应该以一定的比例添加，否则将对胰岛β细胞的分化和功能带来负面影响。
[0011]补充添加物中添加的肝细胞生长因子和表皮生长因子刺激胰岛β细胞增殖，烟酰胺促进细胞的增殖分化，3
‑
异丁基
‑1‑
甲级黄嘌呤用于抑制细胞增殖并促进细胞分化，使得细胞分化的持续进行。
[0012]在该方案中，激活素A在诱导分化培养液中的终浓度为40
‑
50ng/ml，例如，可以是40ng/ml，可以是42ng/ml本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：A1、传代培养：将人脂肪间充质干细胞体外培养3
‑
5代，至细胞密度为80
‑
90%时消化、富集细胞，得到人间充质干细胞；A2、细胞分化：所述人间充质干细胞在诱导分化培养液中培养5
‑
7天，得到胰腺内胚层细胞球，随后加入补充添加物继续培养7
‑
12天，得到分化成熟的胰岛β细胞；所述诱导分化培养液包括以下组分：DMEM/F12培养液、40
‑
50ng/ml激活素A、0.5
‑
0.7wt%的N2补充物、0.5
‑
0.7wt%的B27补充物、0.4
‑
0.6wt%的胎牛血清、1.5
‑
2.5μM维甲酸、45
‑
55 ng/ml角质细胞生长因子、5
‑
10ng/ml PDX1人重组蛋白和15
‑
25ng/ml NKX2.2人重组蛋白；以所述诱导分化培养液为参考，所述补充添加物包括以下组分：35
‑
65ng/ml肝细胞生长因子、6
‑
10mM烟酰胺、80
‑
120μM 3
‑
异丁基
‑1‑
甲级黄嘌呤和40
‑
60ng/ml表皮生长因子。2.根据权利要求1所述的以脂肪间充质干细胞分化胰岛β细胞的方法，其特征在于，所述补充添加物还包括以下组分：2
‑
8ng/ml PDX1人重组蛋白和10
‑
20ng/ml NKX2.2人重组蛋白。3.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈继冰，王雪莹，
申请(专利权)人：广州四叶草健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：