【技术实现步骤摘要】
本申请涉及卵巢早衰治疗的，更具体地说，它涉及一种用于治疗卵巢早衰的外泌体药物及其制备方法。
技术介绍
1、卵巢功能衰退可分为生理性和病理性二种。生理性卵巢功能衰退是指50岁以后女性出现绝经，是人体衰老的自然进程。病理性卵巢功能衰退是指40岁以前出现绝经。卵巢功能衰退的特点是女性卵巢中的卵泡数量显著减少且不成熟；是雌激素水平降低导致的。其症状包括潮热多汗、面部潮红、性欲低下，还容易引起失眠、记忆力减退、骨密度降低和心脏疾病等。临床治疗方法包括服用雌孕激素复合制剂、钙剂和维生素d等，定期补充该类药物可缓解症状，但补充的剂量难以精确掌控，容易引起厌食、呕吐、头昏、腹痛、乳腺增生和乳腺癌等副作用。
2、近年来，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)、干细胞外泌体(exosome，exo)以及基因修饰外泌体类药物因其致瘤性低、起效快以及疗效强的优势被广泛关注。目前的研究表明，exo-mir-126-5p具有治疗卵巢早衰的效果，但是其存在治疗效果不佳的问题；以exo-mir-126-5p治疗模型雌性大鼠后，其血清性激素的水平和正常年轻雌性大鼠还是有较大的差距，子宫重量等数据还达不到年轻雌性大鼠的水平。
技术实现思路
1、为了进一步提高外泌体类药物的卵巢早衰治疗效果，本申请提供一种用于治疗卵巢早衰的外泌体药物及其制备方法。
2、第一方面，本申请提供一种用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，采用如下的技术方案：
3、一种用于治疗卵巢早衰的外泌
4、通过采用上述技术方案，mir-10a-5p的主要作用在于抑制卵泡细胞凋亡来实现治疗卵巢早衰，而mir-126-3p的主要作用在于促进卵巢血管生成来实现卵巢早衰的治疗。本申请的exo-mir-10a-5p/126-3p中同时含有外源基因mir-10a-5p和外源基因mir-126-3p；这两种外源基因协同影响卵巢早衰相关的代谢，最终显著提高了卵巢早衰的治疗效果。具体为：和单独以其中一种外源基因治疗卵巢早衰相比，动物实验结果表明，本申请的外泌体治疗后，雌鼠血清中卵泡刺激素(fsh)显著降低，雌二醇(e2)、抗缪勒管激素(amh)和卵巢重量都明显增加。
5、可选的，所述外泌体药物为液体制剂时，所述外泌体药物内exo-mir-10a-5p/126-3p的含量为(1-10)×1011个/ml。
6、可选的，所述固体制剂包括明胶胶囊、软胶囊、含片、口香糖和干燥粉末；所述液体制剂包括喷雾和溶液。
7、在该方案中，为适应使用环境，在制备相关剂型的产品时，以常规手段添加常规组分即可使得本申请的外泌体药物满足相关药物剂型的要求。
8、可选的，所述外泌体药物为溶液剂型时，所述溶液包括分泌所述exo-mir-10a-5p/126-3p的细胞培养液和所述exo-mir-10a-5p/126-3p；或者所述溶液包括分泌所述exo-mir-10a-5p/126-3p的细胞培养液、磁化水和所述exo-mir-10a-5p/126-3p。
9、可选的，所述磁化水的制备方法包括以下步骤：将水置于500-1000t的磁场下磁化1-3h。
10、通过采用上述技术方案，通过实验发现将外泌体置于磁化水时，其具有更优异的治疗效果，主要表现在治疗时间显著缩短，将治疗时间从4周缩短为3周内。其原因可能是磁化水对外泌体的膜结构有一定的调控作用，使得外泌体能够充分释放至靶标；或者磁化水进入细胞后，影响细胞代谢，在磁化水和外泌体的共同作用下显著加快了治疗周期。
11、第二方面，本申请提供一种上述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，采用如下的技术方案：
12、上述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，包括以下步骤：
13、步骤1、准备间充质干细胞和重组慢病毒，备用；所述重组慢病毒上包括mir-10a-5p和mir-126-3p；
14、步骤2、使得所述间充质干细胞和所述重组慢病毒接触，培养，获得重组间充质干细胞；
15、步骤3、对获得的重组间充质干细胞扩大培养，然后离心，取上清液，所述上清液中含有exo-mir-10a-5p/126-3p。
16、可选的，制备重组慢病毒时慢病毒的序列如seq id no:1所示，所述mir-10a-5p的序列如seq id no:2所示，所述mir-126-3p的序列如seq id no:3所示。
17、可选的，所述重组慢病毒上还包括抗性筛选基因和荧光标记基因。其中抗性筛选基因是用于在步骤2中通过抗性基因筛选获得含有重组慢病毒的重组间充质干细胞，而荧光标记基因用于在步骤2中通过荧光现象快速、便捷判断得到的细胞均为重组间充质干细胞。
18、可选的，步骤3中进行所述重组间充质干细胞扩大培养时，包括将重组间充质干细胞置于间充质干细胞选择培养基上培养并且于间充质干细胞选择培养基内添加磁化水的步骤。
19、通过采用上述技术方案，在重组间充质干细胞培养过程中就加入磁化水，磁化水对重组间充质干细胞的细胞代谢起到一定的调控作用，使得以磁化水培养的重组间充质干细胞分泌的外泌体用于治疗卵巢早衰时，进一步提高治疗效果，使得治疗周期缩短。
20、可选的，所述磁化水的制备方法包括以下步骤：将水置于500-1000t的磁场下磁化1-3h。
21、在一些实施方案中，磁场强度为500-620t、580-760t、750-840t、800-920t或者900-1000t。在一个具体实施例中，磁场强度为500t、540t、680t、730t、820t、940t或者1000t。
22、在一些实施方案中，磁化时间为1-2h、1.5-2.3h或者2.1-3.0h。在一个具体实施例中，磁化时间为1h、1.3h、1.8h、2.1h、2.6h或者3.0h。
23、可选的，所述磁化水的添加时间为：所述上清液内所述exo-mir-10a-5p/126-3p含量为(1-10)×105个/ml时添加所述磁化水，以及所述上清液内所述exo-mir-10a-5p/126-3p含量为(1-10)×108个/ml时再次添加所述磁化水；每次所述磁化水的添加量为所述间充质干细胞选择培养基体积的5-10％。
24、通过采用上述技术方案，第一次添加磁化水的主要目的是通过对重组间充质干细胞的代谢调控，以达到提高治疗效果的目的；第二次添加磁化水的主要目的是磁化水能够有余量进入靶细胞内，参与靶细胞的代谢调控。通过这两次磁化水的添加显著提高卵巢早衰的治疗效果。另外，两次添加磁化水的原因还在于，一次性添加太多的磁化水将影响重组间充质干细胞的数量，而一次添加少量的磁化水时不能达到理想的治疗效果。因此，两次添加磁化水能够从多方面提高本申请exo-mir-10a-5p/126本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述外泌体药物中含有Exo-miR-10a-5p/126-3p；所述外泌体药物为固体制剂或者液体制剂。
2.根据权利要求1所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述外泌体药物为液体制剂时，所述外泌体药物内Exo-miR-10a-5p/126-3p的含量为(1-10)×1011个/mL。
3.根据权利要求1所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述固体制剂包括明胶胶囊、软胶囊、含片、口香糖和干燥粉末；所述液体制剂包括喷雾和溶液。
4.根据权利要求1所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述外泌体药物为溶液剂型时，所述溶液包括分泌所述Exo-miR-10a-5p/126-3p的细胞培养液和所述Exo-miR-10a-5p/126-3p；或者所述溶液包括分泌所述Exo-miR-10a-5p/126-3p的细胞培养液、磁化水和所述Exo-miR-10a-5p/126-3p。
5.根据权利要求4所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述磁化水的制备方法包括以下步
6.权利要求1-3任意一项所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，其特征在于，制备重组慢病毒时慢病毒的序列如SEQ ID NO:1所示，所述miR-10a-5p的序列如SEQ ID NO:2所示，所述miR-126-3p的序列如SEQ ID NO:3所示。
8.根据权利要求6所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，其特征在于，步骤3中进行所述重组间充质干细胞扩大培养时，包括将重组间充质干细胞置于间充质干细胞选择培养基上培养并且于间充质干细胞选择培养基内添加磁化水的步骤。
9.根据权利要求8所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，其特征在于，所述磁化水的制备方法包括以下步骤：将水置于500-1000T的磁场下磁化1-3h。
10.根据权利要求8所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物的制备方法，其特征在于，所述磁化水的添加时间为：所述上清液内所述Exo-miR-10a-5p/126-3p含量为(1-10)×105个/mL时添加所述磁化水，以及所述上清液内所述Exo-miR-10a-5p/126-3p含量为(1-10)×108个/mL时再次添加所述磁化水；每次所述磁化水的添加量为所述间充质干细胞选择培养基体积的5-10%。
...【技术特征摘要】
1.一种用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述外泌体药物中含有exo-mir-10a-5p/126-3p；所述外泌体药物为固体制剂或者液体制剂。
2.根据权利要求1所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述外泌体药物为液体制剂时，所述外泌体药物内exo-mir-10a-5p/126-3p的含量为(1-10)×1011个/ml。
3.根据权利要求1所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述固体制剂包括明胶胶囊、软胶囊、含片、口香糖和干燥粉末；所述液体制剂包括喷雾和溶液。
4.根据权利要求1所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述外泌体药物为溶液剂型时，所述溶液包括分泌所述exo-mir-10a-5p/126-3p的细胞培养液和所述exo-mir-10a-5p/126-3p；或者所述溶液包括分泌所述exo-mir-10a-5p/126-3p的细胞培养液、磁化水和所述exo-mir-10a-5p/126-3p。
5.根据权利要求4所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物，其特征在于，所述磁化水的制备方法包括以下步骤：将水置于500-1000t的磁场下磁化1-3h。
6.权利要求1-3任意一项所述用于治疗卵巢早衰的外泌体药物...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈继冰，王雪莹，
申请(专利权)人：广州四叶草健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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