一种产丙酸的工程益生菌的构建与应用制造技术

本发明专利技术提供一种合成胞外丙酸的工程益生菌、构建方法，及其在医药、农药、食品等领域中的应用。所述益生菌包括导入四种基因构成的丙酸人工合成途径，所述四种基因包括第一种编码乳酸脱氢酶的基因ldhA，第二种编码丙酸辅酶A

【技术实现步骤摘要】
一种产丙酸的工程益生菌的构建与应用


[0001]本专利技术属于基因工程和微生物发酵
，具体涉及一种产丙酸的工程益生菌、构建方法、发酵工艺及其在医药，畜牧业，食品，保健或化工领域中的应用。

技术介绍

[0002]丙酸(Propanoic Acid，PA)是肠道菌群代谢产生的短链脂肪酸(short
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chain fatty acids，SCFA)之一，主要以游离的形式存在。已有研究证实丙酸具有许多重要的生理功能，参与物质代谢、促进肠道组织发育、增强机体免疫等生理活动。已有研究表明丙酸对于炎症性肠病(Inflammatory bowel disease，IBD)有良好的治疗效果，能够改善肠道屏障功能。
[0003]然而直接补充丙酸存在生物利用度低、持续作用效果差等弊端；使用一些产丙酸的天然细菌，例如丙酸梭菌，韦荣氏球菌，嗜黏蛋白阿克曼菌等等，也能改善肠道炎症，但是大多数天然产丙酸细菌都是非益生菌，可能存在一定的毒力因子，因而导致肠道菌群紊乱。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是克服上述现有技术的不足，通过合成生物学手段对天然益生菌进行合理设计，添加丙酸合成、表达通路上的基因，使得天然益生菌从无到有产生丙酸，并实现机体肠道屏障功能的修复。具体地，
[0005]本专利技术第一方面，提供了一种产丙酸的工程益生菌，所述工程益生菌包括导入丙酸合成途径中的四种基因的修饰，所述四种基因包括：第一种包括编码乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的基因ldhA，第二种包括编码丙酸辅酶A
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转移酶(Propionate CoA
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transferase,PCT)的基因pct，第三种包括编码乳糖辅酶A脱水酶(Lactoyl
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CoA dehydratase,LCD)的基因lcdA，第四种包括编码丙烯酰辅酶a还原酶(Acryloyl CoAreductase,ACU)的基因acuI。
[0006]所述工程益生菌经过四种基因的修饰，可以合成终产物丙酸。其中，
[0007]通过第一种基因，使得益生菌可以在丙酮酸基础上合成L
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乳酸，这是丙酸合成的第一步；
[0008]通过第二种基因，使得益生菌能够合成乳酰辅酶A，这是丙酸合成的第二步；
[0009]通过第三种基因，使得益生菌进一步可以合成丙烯酰辅酶A，这是丙酸合成的第三步；
[0010]通过第四种基因，使得益生菌可以合成丙酰基辅酶A，同时在第二种基因作用下合成终产物丙酸。
[0011]优选的，所述第一种基因包括但不限于来源于肠道细菌粪肠球菌属Enterococcus faecalis的乳酸脱氢酶编码基因ldhA。
[0012]更优选的，所述ldhA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0013]ldhA的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌
中表达的密码子优化序列，或者SEQ ID NO:1的突变序列，上述核苷酸序列具有编码LDH蛋白的功能。
[0014]优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:1具有至少90％的同一性，优选的，与SEQ ID NO:1具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:1具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:1能够杂交，以上核苷酸序列均具有编码LDH蛋白的功能。
[0015]优选的，所述ldhA的核苷酸序列编码的LDH蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。或者如SEQ ID NO:2的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:2具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:2具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有LDH蛋白的功能。
[0016]所述第二种基因包括但不限于来源于肠道细菌嗜热产乙酸菌属Moorella thermoacetica的丙酸辅酶A
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转移酶编码基因pct。
[0017]更优选的，所述pct的核苷酸序列可以如SEQ ID NO:3所示。
[0018]pct的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。或者SEQ ID NO:3的突变序列，上述核苷酸序列具有编码PCT蛋白的功能。
[0019]优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:3具有至少90％的同一性，优选的，与SEQ ID NO:3具有至少95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:3具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:3能够杂交，以上核苷酸序列均具有编码PCT蛋白的功能。
[0020]优选的，所述pct的核苷酸序列编码的PCT蛋白的序列如SEQ ID NO:4所示。或者如SEQ ID NO:4的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:4具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:4具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有PCT蛋白的功能。
[0021]所述第三种基因来源于丙酸梭菌属Clostridium propionicum的乳糖辅酶A脱水酶的编码基因lcdA。
[0022]更优选的，lcdA的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0023]lcdA的核苷酸序列也可以是上述序列的互补、或者简并序列，更适合工程益生菌中表达的密码子优化序列。或者SEQ ID NO:5的突变序列，上述核苷酸序列具有编码LCD蛋白的功能。
[0024]优选的，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:5具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性等等；2)相对于SEQ ID NO:5具有一个或多个核苷酸的缺失、插入或者替换；3)在严格杂交条件下与SEQ ID NO:5能够杂交；以上核苷酸序列均具有编码LCD蛋白的功能。
[0025]优选的，所述lcdA的核苷酸序列编码的LCD蛋白的序列如SEQ ID NO:6所示。或者如SEQ ID NO:6的突变序列，更优选地，所述突变序列包括：1)与SEQ ID NO:6具有至少90％的同一性，优选的，具有例如，至少92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的同一性
等等；2)相对于SEQ ID NO:6具有一个或多个氨基酸的缺失、插入或者替换；以上氨基酸序列均具有LCD蛋白的功能。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌包括丙酸合成途径中的四种基因的修饰，所述四种基因包括：第一种包括编码乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的基因ldhA，第二种包括编码丙酸辅酶A
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转移酶(Propionate CoA
‑
transferase,PCT)的基因pct，第三种包括编码乳糖辅酶A脱水酶(Lactoyl
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CoAdehydratase,LCD)的基因lcdA，第四种包括编码丙烯酰辅酶a还原酶(Acryloyl
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CoA reductase,ACU)的基因acuI。2.根据权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，所述工程益生菌还包括第五种基因修饰，其中，所述第五种基因修饰包括基于丙酮酸合成乙酸天然途径中的酶的活性降低或者表达被抑制，优选的，所述第五种基因包括编码丙酮酸甲酸裂解酶(Pyruvate formatelyase,PFL)的基因pflB、编码丙酮酸脱氢酶(Pyruvate dehydrogenase,PDH)的基因poxB和/或编码乙酸激酶(Acetate kinase,AK)的基因ackA。3.根据权利要求1
‑
2任一所述的工程益生菌，其特征在于，所述第一种至第四种基因修饰使得基因编码的酶的活性提高或过表达，第五种基因修饰使得基因编码的酶的活性降低或表达被抑制，优选的，所述使得编码的酶的活性提高或者过表达的基因修饰方式包括点突变，连接强启动子，连接增强子，提高拷贝数、外源导入或者融合共表达，所述使得编码的酶的活性降低或表达被抑制的基因修饰方式包括点突变，缺失，插入，反义polynucleotides，siRNA，microRNA，CRISPR。4.根据权利要求1
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3任一所述的工程益生菌，其特征在于，所述益生菌包括益生大肠杆菌、酵母菌、益生芽孢菌、丙酸梭菌、乳杆菌、双歧杆菌、放线菌等等，...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄鹤，程孝明，高梦学，王丽娜，康广博，高欣然，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：