用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用技术

本发明专利技术涉及一种用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用，所述霍乱弧菌为产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌，所述检测引物和探针包括分别针对rfb O1基因、rfbO139基因和ctxA基因的引物和探针；序列分别如SEQ ID No:1

【技术实现步骤摘要】
用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用


[0001]本专利技术涉及一种用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用，应用在外环境水体中霍乱弧菌的监测领域。

技术介绍

[0002]产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌是导致全球霍乱流行的病原体，由于霍乱弧菌可定居水体并通过粪口途径传播，所以快速、准确地监测外环境水体中该类霍乱弧菌活菌成为防控霍乱流行的重要手段。传统细菌培养法是检测霍乱弧菌的“金标准”[PMID:31427135,PMID:20739485]，但其缺点是流程长达5
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7天左右，操作过程费时费力，且影响因素较多，灵敏度偏低[PMID:24101641]。近年来，越来越多的学者利用实时荧光PCR结合叠氮溴化丙锭(PMA)的方法对活菌检测进行探索[PMID:17544161]，但目前仅有Wu等利用PMA结合qPCR对活的非可培养状态(VBNC)的O1群霍乱弧菌进行了计数研究[PMID:26001818]。但现有对于区分O1群和O139群霍乱弧菌的活菌仍具有局限性，另外也无法检测霍乱肠毒素基因(ctxA)的携带情况。
[0003]与qPCR相比，微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)作为第三代PCR技术，其能提供了更灵敏、更精确、更可重复的数据，并对通常存在于环境样品中的PCR抑制物质表现出更强的耐受性[PMID:28546538]，并可做到绝对定量。自2011年商业化以来，它已被广泛应用于临床和环境研究[PMID:34603226，PMID:25543243]。近年来，为缩减检测时长、提高检测效率，在单重ddPCR的基础上，多重ddPCR方法被开发出来，在保证准确性和灵敏度的同时还可实现多个靶标的检测。如利用多重ddPCR定量检测地表水中产志贺毒素大肠杆菌(STEC)、肠道沙门氏菌和单核增生李斯特菌的污染水平[PMID:29593692]，同时检测土壤中五种生物威胁病原体[PMID:35966705]等。然而，目前仅有Zhao等开发了一种PMA
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ddPCR作为新的定量霍乱弧菌VBNC细胞的方法(PMID:34796126)，其只针对O1群霍乱弧菌的单个特异性基因，且无法检测O139群霍乱弧菌和霍乱肠毒素基因。
[0004]因此，提供一种能同时绝对定量判断待测样品中产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌的活菌数量以及判断霍乱肠毒素潜力，且准确性、灵敏度俱佳的用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用己成为当务之亟。

技术实现思路

[0005]为了克服现有针对霍乱弧菌的检测中仅能判断产毒型O1群霍乱弧菌活菌数量，但无法同时检测O139群霍乱弧菌活菌数量以及霍乱肠毒素基因的缺点，本专利技术提供一种用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用，采用特别设计的引物和探针，通过PMA处理与多重ddPCR扩增技术的配合，能同时绝对定量判断待测样品中产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌的活菌数量以及判断霍乱肠毒素潜力，且准确性、灵敏度俱佳。
[0006]本专利技术的技术方案如下：
[0007]一种用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针，所述霍乱弧菌为产毒型O1群霍乱弧菌
和产毒型O139群霍乱弧菌，所述检测引物和探针包括分别针对rfb O1基因、rfb O139基因和ctxA基因的引物和探针；
[0008]其中，针对rfb O1基因的上游引物rfb O1
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F的序列如SEQ ID No:1所示，下游引物rfb O1
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R的序列如SEQ ID No:2所示，探针rfb O1
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P的序列如SEQ ID No:3所示；
[0009]针对rfb O139基因的上游引物rfb O139
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F的序列如SEQ ID No:4所示，下游引物rfb O139
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R的序列如SEQ ID No:5所示，探针rfb O139
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P的序列如SEQ ID No:6所示；
[0010]针对ctxA基因的上游引物ctxA
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F的序列如SEQ ID No:7所示，下游引物ctxA
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R的序列如SEQ ID No:8所示，探针ctxA
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P的序列如SEQ ID No:9所示。
[0011]本申请的用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针、检测方法以及应用采用特别设计的引物和探针，通过PMA处理与多重ddPCR扩增技术的配合，能同时绝对定量判断待测样品中产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌的活菌数量以及判断霍乱肠毒素潜力，且准确性、灵敏度俱佳。其将微滴式数字PCR与PMA活细胞荧光染料结合使用，开发了多重ddPCR方法，旨在更加准确、灵敏地同时定量检测产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌的拷贝浓度及霍乱肠毒素ctxA基因的拷贝浓度。利用编码O1群和O139群霍乱弧菌的抗原决定簇基因rfb O1和rfb O139的单拷贝基因性质，将多重ddPCR检测出的两种基因的拷贝浓度经过换算定量出O1群和O139群霍乱弧菌的活菌浓度。并根据ctxA基因的拷贝浓度评价霍乱弧菌产生霍乱肠毒素的潜力。该方法的应用可为霍乱防控和预警提供依据。
[0012]微滴式数字PCR作为第三代PCR技术，通过将反应体系微滴化处理并分配至独立的反应室内，在一定反应条件下进行扩增并读取各反应室内荧光终信号，结合泊松分布统计原理，从而能够直接测定初始模板的拷贝数，无需标准曲线即可实现绝对定量。为缩减检测时长、提高检测效率，在单重ddPCR的基础上，本案设计开发了多重ddPCR方法，即在同一个反应体系内加入浓度优化的三对特异性引物和探针(rfb O1，rfb O139和ctxA基因)，在保证准确性和灵敏度的同时实现多个靶标的检测。对引物、探针的设计要求主要包括：一是特异性，即能够分别编码O1群、O139群霍乱弧菌菌体抗原和霍乱肠毒素的特异性基因，同时该引物在其它菌种无法扩增；二是靶基因的单拷贝性，即利用全基因组比对证实编码O1群和O139群霍乱弧菌抗原决定簇基因(rfbO1和rfbO139)为单拷贝基因(即一个菌体细胞只携带一个基因拷贝)。通过确定rfb O1和(或)rfb O139的基因拷贝数就可以计算出霍乱弧菌菌体活细胞数量，实现绝对定量的目的。
[0013]PMA是一种能与DNA结合的光反应染料，不具有细胞膜渗透性，无法穿透活细胞完整的细胞膜，但可以很容易通过受损的细胞膜渗透到死亡细胞中。进入细胞后，在强光照射下，PMA的叠氮基转化为反应性的硝基，硝基进一步与DNA链的碳氢化合物部分反应形成一种强的氮碳共价键。这种修饰导致DNA的结构变化和不溶性，从而导致DNA在提取过程中丢失，进而阻碍死细胞中目标DNA的PCR扩增。由于细菌膜的敏感性和完整性不同，不同物种对胁迫的敏感性也不同，因此应针对每个物种优化DNA活性染料的使用(PMID:22940102本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测霍乱弧菌的检测引物和探针，所述霍乱弧菌为产毒型O1群霍乱弧菌和产毒型O139群霍乱弧菌，其特征在于：所述检测引物和探针包括分别针对rfb O1基因、rfb O139基因和ctxA基因的引物和探针；其中，针对rfb O1基因的上游引物rfb O1
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F的序列如SEQ ID No:1所示，下游引物rfb O1
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R的序列如SEQ ID No:2所示，探针rfb O1
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P的序列如SEQ ID No:3所示；针对rfb O139基因的上游引物rfb O139
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F的序列如SEQ ID No:4所示，下游引物rfb O139
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R的序列如SEQ ID No:5所示，探针rfb O139
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P的序列如SEQ ID No:6所示；针对ctxA基因的上游引物ctxA
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F的序列如SEQ ID No:7所示，下游引物ctxA
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R的序列如SEQ ID No:8所示，探针ctxA
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P的序列如SEQ ID No:9所示。2.采用权利要求1所述的检测引物和探针检测霍乱弧菌的方法，其特征在于：主要包括以下依序进行的步骤：(一)PMA处理：在待测样品菌悬液中加入适量PMA水溶液并混匀，并使混合液中PMA水溶液的摩尔终浓度为15
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20μM，再避光孵育15
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20min，之后置于冰上，同时用650W的卤素灯曝光20
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25min，最后提取样品DNA；(二)多重ddPCR反应：对步骤一获得样品DNA进行多重ddPCR扩增反应...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨劲松，徐海滨，柯自立，
申请(专利权)人：福建省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：