一种检测乳酸菌的引物组、利用PMA-qPCR检测乳酸菌活菌数的方法及应用技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种检测乳酸菌的引物组、利用PMA

【技术实现步骤摘要】
一种检测乳酸菌的引物组、利用PMA
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qPCR检测乳酸菌活菌数的方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种检测乳酸菌的引物组、利用PMA
‑
qPCR检测乳酸菌活菌数的方法及应用。

技术介绍

[0002]酸奶是益生菌的良好载体，乳酸菌对人体的保健作用不断被人们所认识，酸奶制品发展迅速，越来越多的具有特殊益生功能的乳酸菌被添加到乳品中。发酵乳中的活菌数对于发酵乳的品质尤其重要，发酵乳的国家食品法典标准发酵乳(现行标准号为GB 19302
‑
2010)中规定，发酵乳中乳酸菌至少要大于1
ⅹ
106CFU/g。乳酸菌活菌的数量直接影响着发酵乳的质量，是评价活性乳酸菌制品质量的重要指标之一，因此检测发酵乳中的每种乳酸菌活菌数对于乳制品品质是十分重要的。
[0003]对于乳酸菌活菌计数的方法主要有传统平板计数方法、现代分子生物学定量方法。其中传统活菌检测方法包括平板计数法、基于显微镜的计数法、三磷酸腺苷(ATP)生物发光试验。传统的平板计数方法操作繁琐，检测周期长，检测结果具有一定的误差，同时面对由多菌种的复合样品的检测还需要寻找合适的选择性培养基。基于普通的光学显微镜的计数法不能区分死菌和活菌。三磷酸腺苷(ATP)生物发光试验不能区分微生物与非微生物ATP，不能特异性地区分微生物的种类，并且ATP提取剂等含有的某些离子会对ATP的测定造成干扰和抑制发光作用，其灵敏度低。现代分子生物学定量方法分子生物学方法主要是基于PCR(polymerase chain reaction)的方法，其中常用的是实时荧光定量PCR(Real
‑
Time qPCR)技术。
[0004]实时荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems公司提出，它在PCR体系中可标记特异性PCR产物的荧光基团，利用荧光信息的积累以达到实时检测PCR的进程，获得S型的荧光扩增曲线，最终使用标准曲线对于未知模板进行定量分析研究。利用实时荧光PCR技术直接检测mRNA是公认地比较适合检测活菌的标准之一，mRNA是属于胞内生存期较短的分子，是活细胞的信号分子，故而可作为评价活细胞的标志。但由于细胞内的mRNA不稳定，易被核酸酶快速降解导致误差，会对实验结果产生一些假阳性的误导，从而影响实验结果的准确性。
[0005]叠氮溴化丙锭(Propidium monoazide，PMA)是一种常见的光敏染料，能与死亡细胞DNA的共价结合，可以有效区分活的和死的或膜损坏的细菌：在强可见光作用下，能选择性穿透受损细胞，随后通过暴露在明亮的可见光下与细胞外DNA或非活细胞的DNA结合形成稳定的共价高亲和力键，一旦与PMA结合，DNA将无法在随后的PCR反应中被扩增，而通常只有受完整的活细胞膜保护的DNA才能被qPCR检测到。PMA与qPCR相结合的方法，可以有效避免常规qPCR的缺陷，避免由于菌株细胞内的mRNA不稳定出现的假阳性误差。因此，建立一种使用PMA
‑
qPCR技术有效区分活菌和死菌、快速并准确地定量检测复合乳酸菌活菌数的方法是十分必要的。PMA在与死亡细胞DNA的共价结合时受到PMA浓度、光照时间、等多种因素的
影响，因此不同的菌种在做活菌定量检测时所用PMA的条件也是不同的。另外，需要强调是的是：采用PMA
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qPCR方法的检测结果准确性的关键在于不同乳酸菌qPCR扩增时特异性引物的应用。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的提供一种检测乳酸菌的引物组，利用该引物组进行乳酸菌活菌数PMA
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qPCR检测，可以快速、高效、准确检测每株乳酸菌的活菌数。
[0007]本专利技术提供了一种检测乳酸菌的引物组，包括第一引物对、第二引物对和第三引物对中的三种、两种或一种；
[0008]所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNo.2所示的下游引物；
[0009]所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNo.4所示的下游引物；
[0010]所述第三引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ IDNo.6所示的下游引物。
[0011]本专利技术提供了一种检测乳酸菌的方法，包括如下步骤：
[0012]提取待检样品中的基因组DNA；
[0013]当所述乳酸菌采用上述技术方案所述的引物组中的第一引物对进行PCR扩增，若出现第一引物对所对应的阳性扩增产物，则判定待测样品包含干酪乳杆菌Zhang；
[0014]当所述乳酸菌采用上述技术方案所述的引物组中的第二引物对进行PCR扩增，若出现第二引物对所对应的阳性扩增产物，则判定待测样品包含德式乳杆菌保加利亚亚种ND02；
[0015]当所述乳酸菌采用上述技术方案所述的引物组中的第三引物对进行PCR扩增，若出现第三引物对所对应的阳性扩增产物，则判定待测样品包含嗜热链球菌ND03。
[0016]本专利技术提供了一种利用PMA
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qPCR检测乳酸菌活菌数的方法，包括如下步骤：
[0017]对待检样品进行PMA染色，得到PMA染色后的待检样品；
[0018]提取所述PMA染色后的待检样品中的基因组DNA；
[0019]当所述乳酸菌包括干酪乳杆菌Zhang时，将所述基因组DNA作为模板，采用上述技术方案所述的引物组中的第一引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第一CT值；将已知浓度的含有干酪乳杆菌Zhang目的基因片段的阳性质粒以10倍梯度稀释作为标准品，采用上述技术方案所述的第一引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第一标准曲线回归方程；将所述第一CT值代入第一标准曲线回归方程中，得到待检样品中干酪乳杆菌Zhang的活菌浓度；
[0020]当所述乳酸菌包括德式乳杆菌保加利亚亚种ND02时，将所述基因组DNA作为模板，采用上述技术方案所述的引物组中的第二引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第二CT值；将已知浓度的含有德式乳杆菌保加利亚亚种ND02目的基因片段的阳性质粒以10倍梯度稀释作为标准品，采用上述技术方案所述的第二引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第二标准曲线回归方程；将所述第二CT值代入第二标准曲线回归方程中，得到待检样品中德式乳杆菌保加利亚亚种ND02的活菌浓度；
[0021]当所述乳酸菌包括嗜热链球菌ND03时，将所述基因组DNA作为模板，采用上述技术方案所述的引物组中的第三引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第三CT值；将已知浓度的含有嗜热链球菌ND03目的基因片段的阳性质粒以10倍梯度稀释作为标准品，采用上述技术方案所述的第三引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第三标准曲线回归方程；将所述第三CT值代入第三标准曲线回归方程中，得到待检样品中嗜热链球菌ND03的活菌浓度。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测乳酸菌的引物组，其特征在于，包括第一引物对、第二引物对和第三引物对中的三种、两种或一种；所述第一引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的下游引物；所述第二引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的下游引物；所述第三引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID No.6所示的下游引物。2.一种检测乳酸菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待检样品中的基因组DNA；当所述乳酸菌采用权利要求1所述的引物组中的第一引物对进行PCR扩增，若出现第一引物对所对应的阳性扩增产物，则判定待测样品包含干酪乳杆菌Zhang；当所述乳酸菌采用权利要求1所述的引物组中的第二引物对进行PCR扩增，若出现第二引物对所对应的阳性扩增产物，则判定待测样品包含德式乳杆菌保加利亚亚种ND02；当所述乳酸菌采用权利要求1所述的引物组中的第三引物对进行PCR扩增，若出现第三引物对所对应的阳性扩增产物，则判定待测样品包含嗜热链球菌ND03。3.一种利用PMA
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qPCR检测乳酸菌活菌数的方法，其特征在于，包括如下步骤：对待检样品进行PMA染色，得到PMA染色后的待检样品；提取所述PMA染色后的待检样品中的基因组DNA；当所述乳酸菌包括干酪乳杆菌Zhang时，将所述基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物组中的第一引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第一CT值；将已知浓度的含有干酪乳杆菌Zhang目的基因片段的阳性质粒以10倍梯度稀释作为标准品，采用权利要求1所述的第一引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第一标准曲线回归方程；将所述第一CT值代入第一标准曲线回归方程中，得到待检样品中干酪乳杆菌Zhang的活菌浓度；当所述乳酸菌包括德式乳杆菌保加利亚亚种ND02时，将所述基因组DNA作为模板，采用权利要求1所述的引物组中的第二引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第二CT值；将已知浓度的含有德式乳杆菌保加利亚亚种ND02目的基因片段的阳性质粒以10倍梯度稀释作为标准品，采用权利要求1所述的第二引物对进行实时荧光定量PCR扩增，得到第二标准曲线回归方程；将所述第二CT值代入第二标准曲线回归方程中，得到待检样品中德式乳杆菌保加利亚亚种ND02的活菌浓度；当所述乳酸菌包括嗜热链球菌ND03时，将所述基因组DNA...

【专利技术属性】
技术研发人员：包秋华，郭丽如，于洁，
申请(专利权)人：内蒙古农业大学，
类型：发明
国别省市：