一种检测细菌的HCR/Exo-III生物探针组合、检测试纸、试剂盒和系统及方法技术方案

本发明专利技术公开了一种检测细菌的HCR/Exo

【技术实现步骤摘要】
一种检测细菌的HCR/Exo
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III生物探针组合、检测试纸、试剂盒和系统及方法


[0001]本专利技术涉及分子检测
，具体地，涉及一种检测细菌的HCR/Exo
‑
III生物探针组合、检测试纸、试剂盒和系统及方法。

技术介绍

[0002]致病细菌对人类健康构成严重威胁。及时、灵敏地检测病原体有助于切断病原体在食物和环境中的传播。迄今为止，细菌检测方法主要分为细菌培养、血清学检测和核酸检测(NATs)。其中，NATs是早期诊断细菌感染引起的疾病的可靠方法。最近的研究表明，细菌16S rRNA含有种间差异信息，典型的细菌拥有约10000个拷贝的16S rRNA，而16S rDNA基因的数量则相对较少。因此，由于每个细菌中都有大量的16S rRNA模板，16S rRNA的检测对于低浓度的病原体检测是有意义和有吸引力的。然而16S rRNA全长片段较长，其二级结构复杂，若以细菌16S rRNA全长片段为检测靶标，检测时间长、成本高、操作复杂，难以实现直接检测。若以细菌16S rRNA部分片段为检测靶标，又难以保证检测片段的特异性和普适性。因此确定准确可靠的16S rRNA特异性靶标对于检测细菌至关重要。
[0003]目前的RNA检测方法包括northern印迹、定量逆转录聚合酶链反应(qRT
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PCR)和逆转录环介导的等温扩增(RT
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LAMP)等。其中，Northern印迹法是一种经典的方法，但其灵敏度仍有待提高。qRT
‑/>PCR具有灵敏度高、特异性强、RNA检测范围广等优点，但它依赖于昂贵的仪器和严格的扩增条件。RT
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LAMP无需特殊仪器和空间即可实现快速、等温扩增。然而，该应用也受到相对较高的反应温度(60～65℃)、复杂的引物和不可避免的气溶胶污染。因此，具有目标扩增和温和培养条件的其他NATs策略正在蓬勃发展。其中，杂交链反应(HCR)是一种等温、无酶、多功能的分子技术，可以直接识别和扩增RNA靶标，且无需逆转录过程。然而，HCR产物通常具有高分子量和低迁移率，这可能会限制其后续应用场景。
[0004]测流层析试纸条是由经济和可持续的纸基材料制成，其多孔基质支持流体运动、柔性基质固定生物分子。侧流层析分析技术(LFA)可通过核酸杂交技术，使待检测物中核酸通过毛细作用，产生移动速度差异，实现分离。待测样品经扩增所得的特异性扩增子与测流层析试纸条的捕获探针核酸杂交，通过标记物，实现特异性识别。然而待测样品经扩增所得的特异性扩增子分子量不能太大，否则会增长杂交时间，降低特异性扩增子的迁移率，降低扩增效率，增加分离的难度。
[0005]因此，普通的HCR产物难以适用于侧流层析技术，将HCR产物转化为低分子并提高扩增效率，对于其与侧流层析技术等柔性材料结合，提高检测设备的便携性，具有重要意义。
[0006]同时，一般的LFA技术仅能对待测样品定性，但难以实现准确定量。比如食物中的病原体、血液中的葡萄糖和环境中的重金属，都有安全限制，只有当剂量超过阈值时，才会导致致命后果。因此，需要进一步实现LFA的定量分析功能。目前，基于智能手机的LFA定量读取器在比色和荧光分析中非常流行。摄像机捕获LFA中的检测信号，由图像处理软件(如
imag e J)转换为绝对值。然而，当拍摄照片进行定量分析时，照明条件、光学设置和焦距在内的各种因素都会给最终结果带来变化，难以实现准确定量。
[0007]为了克服上述缺点，增加检测细菌的特异性，达到定性、定量检测，提高检测设备的便携性，迫切需要找到适用于HCR扩增的细菌16S rRNA特异性片段，增强HCR探针的目标识别能力，实现细菌定性、定量检测，提高检测设备的便携性和操作简便性。

技术实现思路

[0008]本专利技术的目的是克服现有技术的上述不足，提供一种检测细菌的HCR/Exo
‑
III生物探针组合、检测试纸、试剂盒和系统及方法。
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种检测细菌的HCR/Exo
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III生物探针组合。
[0010]本专利技术的第二个目的是提供一种检测细菌的荧光定量检测试纸。
[0011]本专利技术的第三个目的是提供一种检测细菌的荧光定量检测试剂盒。
[0012]本专利技术的第四个目的是提供一种检测细菌的荧光定量检测系统。
[0013]本专利技术的第五个目的是提供一种检测细菌的方法。
[0014]本专利技术在Gene bank中获取金黄色葡萄球菌(Sa)、单核增生李斯特菌(Lm)和鼠伤寒沙门氏菌(St)16S rRNA的全序列，通过MEGA7和RNAdraw软件对比选取，获得Sa、Lm和St 16S rRNA的特异性序列T
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Sa、T
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Lm和T
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St，根据T
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Sa、T
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Lm和T
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St，设计HCR/Exo
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III的发夹探针H1、H2和H3，荧光探针DNA和捕获探针的氨基酸序列，构建检测T
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Sa、T
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Lm和T
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St的检测试纸。在验证检测试纸具有特异性、重复性和稳定性等可行性的前提下，引入辅助DNA来解开实际检测过程中细菌16S rRNA的折叠结构，增强HCR探针的目标识别能力，从而制备得到同时检测Sa、Lm和St的荧光定量检测试纸及其配套检测系统。
[0015]为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的：
[0016]一种检测细菌的HCR/Exo
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III生物探针组合，包括如下发夹探针和辅助DNA：
[0017]检测金黄色葡萄球菌：发夹探针为H1
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Sa、H2
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Sa和H3
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Sa，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示，辅助DNA Helper
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Sa的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
[0018]检测单核增生李斯特菌：发夹探针为H1
‑
Lm、H2
‑
Lm和H3
‑
Lm，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～6所示，辅助DNA Helper
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Lm的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；
[0019]检测鼠伤寒沙门氏菌：发夹探针为H1
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St、H2
‑
St和H3
‑
St，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7～9所示，辅助DNA Helper
‑
St的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。
[0020]一种检测细菌的荧光定量检测试纸，所述荧光定量检测试纸包括硝酸纤维素膜、样品垫、吸收垫和PVC板；其检测区包被的捕获探针如下：检测金黄色葡萄球菌的捕获探针的核苷酸序列如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测细菌的HCR/Exo
‑
III生物探针组合，其特征在于，包括如下发夹探针和辅助DNA：检测金黄色葡萄球菌：发夹探针为H1
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Sa、H2
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Sa和H3
‑
Sa，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：1～3所示，辅助DNA Helper
‑
Sa的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；检测单核增生李斯特菌：发夹探针为H1
‑
Lm、H2
‑
Lm和H3
‑
Lm，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：4～6所示，辅助DNA Helper
‑
Lm的核苷酸序列如SEQ ID NO：12所示；检测鼠伤寒沙门氏菌：发夹探针为H1
‑
St、H2
‑
St和H3
‑
St，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO：7～9所示，辅助DNA Helper
‑
St的核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示。2.一种检测细菌的荧光定量检测试纸，其特征在于，其检测区包被的捕获探针如下：检测金黄色葡萄球菌的捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示，检测单核增生李斯特菌的捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示，检测鼠伤寒沙门氏菌的捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示；其质控区包被的捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：17所示。3.根据权利要求2所述的荧光定量检测试纸，其特征在于，所述捕获探针修饰有链霉亲和素与生物素。4.根据权利要求3所述的荧光定量检测试纸，其特征在于，所述捕获探针的包被量为40～80μM。5.一种检测细菌的荧光定量检测试剂盒，其特征在于，所述荧光定量检测试剂盒中包括权利要求2～4任一所述的荧光定量检测试纸和荧光试剂，所述荧光试剂含有权利要求1所述的HCR/Exo
‑
III生物探针组合、DNA修饰的荧光量子点探针、核酸外切酶Exo
‑Ⅲ
和缓冲液；所述DNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示；所述缓冲液含有Tris
‑
HCl、NaCl、KCl和Mg
2+
。6.根据权利要求5所述的荧光定量...

【专利技术属性】
技术研发人员：李迎春，彭锌，吴庆金，刘江，杨娇，
申请(专利权)人：哈深迪广东生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：