一种引物组合物及其在病原检测中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种由正向引物、反向引物和探针引物构成的引物组合物。正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，探针引物的序列如SEQ ID No.3所示，设计所述引物组合物的靶标序列为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种中一个假想基因（WP_017704201.1）序列。本发明专利技术建立了丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测方法，包括：提取待测样品基因组DNA，以基因组DNA为模板，用引物组合物进行RAA检测；根据LFD试纸条条带确定待测样品是否含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。本发明专利技术检测方法对丁香假单胞菌猕猴桃致病变种DNA的检测灵敏度最低限为1 pg/μL，对菌悬液最低检测限为1

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合物及其在病原检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及猕猴桃致病菌的检测方法，具体涉及采用RAA
‑
LFD技术检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的引物组合物和检测方法。

技术介绍

[0002]猕猴桃细菌性溃疡病是由丁香假单胞菌猕猴桃致病变种（Pseudomonas syringae pv. Actinidiae，Psa）引起的具有毁灭性的病害。Psa致病能力极强，猕猴桃细菌性溃疡病已蔓延至世界主要猕猴桃产区。猕猴桃果园植株一旦感染溃疡病，轻则导致减产，重则毁园，造成严重的经济损失。
[0003]丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的传统鉴定（检测）方法主要是进行发病组织病原菌分离与形态学鉴定、致病性测定等。由于传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期快速做出诊断，因此难以对病害发生情况进行及时的监测和有效控制。
[0004]分子生物学的发展为猕猴桃细菌性溃疡病的诊断提供了快速、灵敏、准确的技术支撑，各类PCR、杂交探针、RAPD、AFLP等分子检测方法已被广泛应用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测鉴定。PCR法在检测特异性和灵敏性上虽有较大的提高，但诊断过程繁琐、周期长、成本高且需要昂贵的仪器和试剂，不能满足快速检测的需求。环介导等温扩增技术（LAMP）用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测和鉴定，虽可以不借助PCR仪等精密仪器，但引物设计比PCR更复杂，并且产物的分析采用浊度、金属指示剂等比色法检测，存在难以区分假阳性的情况。
[0005]重组酶等温扩增技术（Recombinase Aided Amplification，RAA）是一种新型恒温（37~42℃）核酸扩增技术，其显著优点是只需要1对引物即可在39℃的恒温条件下实现模板核酸的扩增。与普通PCR相比，RAA技术具有简单、快速、高效、灵敏度高、特异性强等优点，可在30 min内获得检出扩增产物，反应过程不需要高温变性和低温退火，降低了对精密温控设备的要求，反应时间明显缩短。RAA扩增结果通过与侧流层析试纸条（Lateral Flow Detection，LFD）结合，实现可视化读取，结果可肉眼判读，真正实现病原菌快速现场检测，为植物病原物检测诊断和病害防控提供了快速便捷的技术手段。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题：包括化学农药防治在内的技术手段难以有效遏制猕猴桃细菌性溃疡病的扩展蔓延，丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的快速现场检测具有不容忽视的重要意义。对于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的RAA检测，目前未见相关应用报道。
[0007]本专利技术旨在建立一种方便、快速、灵敏地检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的方法。为有效解决本专利技术的技术问题，实现本专利技术的技术目的，本专利技术提供一种基于RAA
‑
LFD技术检测丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的引物组合物。所述引物组合物由正向引物、反向引物和探针引物构成，设计所述引物组合物的靶标序列为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基
因组中一个假想基因（WP_017704201.1）序列。
[0008]具体地，所述正向引物的序列如SEQ ID No.1所示。在本专利技术中，正向引物为RAA
‑
Psa
‑
F：5
′‑
CACCATGATGCGGAGCTACTACGGCGACTG
‑3′
（SEQ ID NO.1）。
[0009]具体地，所述反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，在本专利技术中，反向引物为RAA
‑
Psa
‑
R：5
′‑
Biotin
‑
AAGTAATTTCCGCAGGAGGGAGGCTGTTAG
‑3′
（SEQ ID NO.2）。由SEQ ID No.2序列获知，反向引物序列5
′
端用生物素（Biotin）标记。作为一优选的实施方式，所用生物素为维生素B7。
[0010]具体地，所述探针引物的序列如SEQ ID No.3所示。在本专利技术中，探针引物（序列）为RAA
‑
Psa
‑
P：5
′‑
FAMACGGCGACTGGTGGCGAGTATTTGAAAGCG/THF/TGGGGAAGTGGGTG/C3
‑
spacer（SEQ ID NO.3）。由SEQ ID No.3序列获知，探针引物5
′
端用荧光素（FAM）标记，距离5
′
端31个碱基的位置处用四氢呋喃（THF）作为dSpacer替代一个碱基，3
′
端用C3
‑
spacer封锁。作为一优选的实施方式，所用荧光素为6
‑
羧基荧光素。
[0011]基于上述设计的引物组合物，本专利技术请求保护一种检测组合物。本专利技术所述检测组合物含有所述的引物组合物。这种组合物用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测，可以制备成适用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测的制剂或试剂。
[0012]基于上述设计的引物组合物，作为一种优选的实施方式，本专利技术请求保护一种检测试剂盒。所述检测试剂盒的构成组分包含所述的引物组合物，用于丁香假单胞菌猕猴桃致病变种的检测。进一步地，所述检测试剂盒的构成组分还包括：装有RAA冻干酶粉的反应单元管、A Buffer、醋酸镁溶液（B Buffer）、去离子水、运行缓冲液和侧流层析试纸条。本专利技术提供了一种丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测的方法，其包括：以待测样本DNA为模板，采用所述的引物组合物进行RAA扩增；采用侧流层析试纸条检测RAA扩增产物，若侧流层析试纸条出现两条棕色条带，一条位于质控区，一条位于检测区，则待测样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；若侧流层析试纸条只在质控区出现一条棕色条带，检测区没有条带，则待测样本中不含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
[0013]所述丁香假单胞菌猕猴桃致病变种检测方法，包括以下具体步骤：1）提取待测样本基因组DNA；2）以待测样本基因组DNA为模板，利用所述引物组合物进行RAA扩增；3）采用侧流层析试纸条进行RAA扩增产物检测。当侧流层析试纸条出现两条棕色条带（Control line and Test line），一条位于质控区，一条位于检测区，则结果为阳性，表明样本中含有丁香假单胞菌猕猴桃致病变种；当侧流层析试纸条只有质控区出现一条棕色条带（Control line），检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本中不含丁香假单胞菌猕猴桃致病变种。
[0014]上述方法中，步骤2）所述RAA
‑
LFD检测的反应体系为：向RAA冻干酶粉中加入25 μL A缓冲液（A Buffer）、12.9 μL超纯水、10 μM正向引物RAA
‑
Psa
‑
F 2 μL、10 μM反向引物RAA
‑...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其特征在于，所述引物组合物由正向引物、反向引物和探针引物构成，所述正向引物的序列如SEQ ID No.1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID No.2所示，所述探针引物的序列如SEQ ID No.3所示，设计所述引物组合物的靶标序列为丁香假单胞菌猕猴桃致病变种基因组中一个假想基因WP_017704201.1序列。2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述反向引物的5
′
端用生物素标记。3.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，所述探针引物的5
′
端用荧光素标记，距离5
′
端第31个碱基的位置用四氢呋喃替代，3
′
端用C3
‑
spacer封锁。4.一种检测组合物，其特征在于，所述检测组合物包含权利要求1至3任一项所述的引物组合物。5.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包含权利要求1至3任一项所述的引物组合物。6.根据权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒还包含装有R...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄丽丽，徐亮胜，刘海龙，
申请(专利权)人：西北农林科技大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：