鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法，该方法主要是利用固体培养基对微生物分泌至胞外的抑菌活性蛋白进行提取，克服了传统提取微生物胞外的抑菌活性蛋白的方法的培养过程十分复杂繁琐，实验周期长，特异性不高的缺点，同时，该方法从固体培养基中直接提取抑菌活性蛋白，针对性很强，也避免了使用大量培养菌液需要耗费时间进行大量的浓缩的劣势，并且对于一些难以在缺氧的液体培养基中生长的好氧型微生物的生长具有更加显著的优势。显著的优势。显著的优势。

【技术实现步骤摘要】
鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体地，涉及一种鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法。

技术介绍

[0002]微生物在生长的过程中会产生一系列的代谢产物，其中分泌至胞外的抑菌活性蛋白属于众多代谢产物的一种。通过对微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因进行鉴定，有助于从基因层面对其抑菌作用进行进一步研究。为了通过异源表达大量获得这种抑菌蛋白，我们首先需要将其提取出来并对其编码基因进行鉴定。
[0003]目前，提取微生物胞外的抑菌活性蛋白的传统的方法主要是通过将相应的菌体在较大规模的液体培养基中(1
‑
10L)，然后在恒温震荡培养箱中进行大量培养；再通过离心获得培养液上清液。收集的上清液再使用孔径为0.22μm的微孔滤膜抽滤除去剩余少量残余细胞和大颗粒物杂质；然后将滤液通过切向流浓缩系统进行较长时间的浓缩(约50mL)。浓缩完成后，再取部分浓缩液进行聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS
‑
PAGE)检测目的蛋白条带；通过上述传统方法，由于细胞的裂解，所获得的溶液中往往含有大量杂蛋白带，并且目的条带较淡，不易区分；从而导致很难对每一个条带进行质谱鉴定；进而导致无法获得抑菌蛋白的氨基酸序列，更不能鉴定其编码基因。
[0004]此外，要获得大量的目标蛋白，传统方法大多都基于液体培养，在使用液体培养基培养微生物时，往往会存在一些好氧菌难以生长或生长不好的情况。此时，耗费大量时间但最终培养基中的菌体却很少，分泌到胞外的抑菌蛋白浓度很低，对后续的提取带来很大的困难。
[0005]因此，亟需一种全新的方法来提取抑菌活性蛋白，并确定其编码基因，来弥补传统方法的不足。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提供一种鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法，克服了传统提取微生物胞外的抑菌活性蛋白的方法的培养过程十分复杂繁琐，实验周期长，特异性不高的缺点，同时，该方法从固体培养基中直接提取抑菌活性蛋白，针对性很强，也避免了使用大量培养菌液需要耗费时间进行大量的浓缩的劣势，并且对于一些难以在缺氧的液体培养基中生长的好氧型微生物的生长具有更加显著的优势。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术提供了一种鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法，包括：
[0008]1)将微生物菌株置于固体培养基中培养，然后，将固体培养基上的菌株收集并进行基因组测序，获得菌株的基因组序列信息和基因组注释信息；
[0009]2)将步骤1)中收集完菌株后的固体培养基切块，离心，收集滤液，对滤液进行SDS
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PAGE检测，确定并分离获得蛋白条带；
[0010]3)将步骤2)得到的蛋白条带取样进行质谱鉴定，并结合步骤1)中获得的菌株的基因组序列信息和基因组注释信息，获得抑菌活性蛋白的氨基酸序列，根据氨基酸序列从基因组编码基因中定位该抑菌活性蛋白的编码基因序列；
[0011]4)对抑菌活性蛋白的编码基因进行克隆表达，将成功表达的蛋白进行纯化、复性以及抑菌活性验证。
[0012]通过上述技术方案，本专利技术鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法与现有的方法相比具有以下优点：
[0013]1、对样品需求量小，仅需极其少量(200μL)的菌液就可以获得相应的抑菌物质，相比以往采用大量摇菌(10
‑
20L)获取上清液来获得抑菌物质的方法对菌液的需求量存在数量级的差异；
[0014]2、特异性高，产生的杂带少，本专利技术方法直接从产生抑菌活性蛋白的固体琼脂中提取抑菌活性物质，针对性强，通过本方法获得的抑菌物质进行SDS
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PAGE分离时，目的条带明显且杂带少，便于得到目的条带；
[0015]3、操作简单，省时，本专利技术方法无需通过液体培养的方式大量获得菌液，大大缩短了传统方法中摇菌所需的时间，且各个步骤均简单，易操作。
[0016]本专利技术的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
[0017]附图是用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本专利技术，但并不构成对本专利技术的限制。在附图中：
[0018]图1是本专利技术的操作流程图；
[0019]图2是实施例1的实际操作流程图及实验结果；
[0020]图3为对比例1的实际操作流程图及实验结果。
具体实施方式
[0021]以下对本专利技术的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。
[0022]在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0023]本专利技术提供了一种鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法，包括：
[0024]1)将微生物菌株置于固体培养基中培养，然后，将固体培养基上的菌株收集并进行基因组测序，获得菌株的基因组序列信息和基因组注释信息；
[0025]2)将步骤1)中收集完菌株后的固体培养基切块，离心，收集滤液，对滤液进行SDS
‑
PAGE检测，确定并分离获得蛋白条带；
[0026]3)将步骤2)得到的蛋白条带取样进行质谱鉴定，并结合步骤1)中获得的菌株的基因组序列信息和基因组注释信息，获得抑菌活性蛋白的氨基酸序列，根据氨基酸序列从基因组编码基因中定位该抑菌活性蛋白的编码基因序列；
[0027]4)对抑菌活性蛋白的编码基因进行克隆表达，将成功表达的蛋白进行纯化、复性以及抑菌活性验证。
[0028]本专利技术提供的鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法，通过从固体培养基中直接提取抑菌活性蛋白，针对性很强，同时无需使用液体培养基进行大量液体培养，也无需耗费时间进行大量的浓缩，此外，对于一些难以在缺氧的液体培养基中生长的好氧型微生物的生长具有更加显著的优势。
[0029]根据本专利技术一种优选的实施方式，在步骤1)中，所述微生物菌株的种类可以在宽的范围内选择，但是为了更好的突出本专利技术的效果，在步骤1)中，所述微生物菌株选自产抑菌活性蛋白Q22的嗜盐古菌菌株Haloferax sp.Q22、产嗜盐菌素H4的Haloferax mediterranei ATCC 33500产嗜盐菌素C8的Halobacterium sp.AS7092、产嗜盐菌素G1的Halobacterium sp.GRB和产嗜盐菌素KPS1的Haloferax sp.KPS1.中的一者；
[0030]优选为嗜盐古菌菌株Haloferax sp.Q22。
[0031]根据本专利技术一种优选的实施方式，在步骤1)中，所述培养的条件可以在宽的范围内选择，但是为了提取这种抑菌蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴定微生物胞外抑菌活性蛋白编码基因的方法，其特征在于，包括：1)将微生物菌株置于固体培养基中培养，然后，将固体培养基上的菌株收集并进行基因组测序，获得菌株的基因组序列信息和基因组注释信息；2)将步骤1)中收集完菌株后的固体培养基切块，离心，收集滤液，对滤液进行SDS
‑
PAGE检测，确定并分离获得蛋白条带；3)将步骤2)得到的蛋白条带取样进行质谱鉴定，并结合步骤1)中获得的菌株的基因组序列信息和基因组注释信息，获得抑菌活性蛋白的氨基酸序列，根据氨基酸序列从基因组编码基因中定位该抑菌活性蛋白的编码基因序列；4)对抑菌活性蛋白的编码基因进行克隆表达，将成功表达的蛋白进行纯化、复性以及抑菌活性验证。2.根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，所述微生物菌株选自产抑菌活性蛋白Q22的嗜盐古菌菌株Haloferax sp.Q22、产嗜盐菌素H4的Haloferax mediterranei ATCC 33500、产嗜盐菌素C8的Halobacteriumsp.AS7092、产嗜盐菌素G1的Halobacterium sp.GRB和产嗜盐菌素KPS1的Haloferax sp.KPS1.中的一者；优选为嗜盐古菌菌株Haloferax sp.Q22。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤1)中，所述培养的条件包括：将微生物菌株的菌液涂布于固体培养基上，放入恒温培养箱在30
‑
45℃下恒温培养，直到菌株长满整个固体培养基；优选所述涂布为涂布平板法；和/或所述收集的过程为先使用洗涤剂清洗固体培养基2
‑
3次，然后将洗下的菌株收集到离心管中，置入离心机中在10000
‑
15000rpm转速下离心8
‑
12min，除去上清液，收集菌株，放置于
‑
80℃冰箱备用；和/或所述洗涤剂选自缓冲液和/或液体培养基培养液。4.根据权利要求1
‑
3中任意一项所述的方法，其中，在步骤2)中，所述收集完菌株后的固体培养基在切块前需再使用无菌的蒸馏水迅速清洗固体培养基2
‑
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【专利技术属性】
技术研发人员：陈绍兴，洪涛，王锐，郝育铃，
申请(专利权)人：安徽师范大学，
类型：发明
国别省市：