细菌性呼吸道病原体的多重检测制造技术

本文公开了用于检测引起呼吸道感染的常见细菌病原体的方法和组合物。在一些实施方案中，使用基于多重核酸的测试方法确定样品中肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌(卡他布兰汉菌)、脑膜炎奈瑟菌和/或肺炎克雷伯菌的存在或不存在。炎克雷伯菌的存在或不存在。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细菌性呼吸道病原体的多重检测
[0001]相关申请
[0002]本申请要求2020年11月5日提交的PCT申请序号PCT/CN 2020/126728的权益，此相关申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003]对序列表的引用
[0004]本申请连同电子格式的序列表一起提交。序列表被提供为题为68EB
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298736
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WO2的文件，创建于2021年11月2日，大小是28kb。电子格式的序列表的信息通过引用以其整体并入本文。
[0005]背景
[0006]领域
[0007]本公开内容涉及用于检测样品中的细菌的方法和组合物，所述细菌诸如肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)(卡他布兰汉菌(Branhamella catarrhalis))、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)和肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)。更具体地，本公开内容涉及通过基于核酸的测试方法检测样品诸如血液样品或呼吸道样品(或其培养物)中的以下一种或更多种：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌(卡他布兰汉菌)、脑膜炎奈瑟菌和肺炎克雷伯菌。
[0008]对相关技术的描述
[0009]肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌(卡他布兰汉菌)、脑膜炎奈瑟菌和肺炎克雷伯菌是与呼吸道感染相关联的六种常见病原体。急性细菌性呼吸道感染是最常见的人类疾病之一。症状的严重程度的范围为轻微的上呼吸道感染(URTI)到严重的下呼吸道感染(LRTI)，其中许多与显著的发病率和死亡率相关联，特别是与儿童、老年人和免疫受损(immunocompromised)或具有潜在共病(诸如先天性心脏缺陷或慢性呼吸道疾病)的那些人中的显著的发病率和死亡率相关联。另外，肺炎链球菌、脑膜炎奈瑟菌和流感嗜血杆菌是世界范围内经常与细菌性脑膜炎相关联的主要病原体，每年有超过120万例病例。肺炎克雷伯菌已被鉴定为主要的医院内病原体，可引起肺炎、支气管炎、尿道和伤口感染。此外，近年来出现的抗生素抗性的肺炎克雷伯菌已成为临床上的严重问题。卡他莫拉菌是引起儿童中耳炎的主要细菌性病原体之一。它还会引起儿童和成人的鼻窦炎、喉炎、气管炎、肺炎和其他呼吸道疾病。此外，金黄色葡萄球菌感染及其并发症的死亡率高达20％，甲氧西林抗性的金黄色葡萄球菌(MRSA)已成为诸如ICU感染、术后感染的医院感染率最高的病原体之一。从感染的发热患者中及时鉴定所有这六种病原体对于抗菌药物管理(antimicrobial stewardship)和疾病控制非常重要。
[0010]目前呼吸道细菌的标准诊断方法是基于培养物的，并且通常需要24小时
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72小时。培养物也具有低灵敏度，例如，阳性微生物学诊断可能仅在大约30％的患有社区获得性肺炎的患者中做出。另外，即使使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI
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TOF MS)技术，表型鉴定也可能出现误差。事实上，Cunningham等人最近报道了使用MALDI
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TOF MS以范围为2.068至2.241的高鉴定评分将多糖奈瑟菌(N.polysaccharea)菌株错误鉴定为脑膜炎
奈瑟菌。这样的错误鉴定是被预期的，因为这两个物种亲缘上密切接近，如通过它们高百分比的16S rRNA同一性(99.3％)所展示的。
[0011]由于广泛的病原体可引起呼吸道感染，因此通常要求对许多不同样本类型进行不同诊断测试的混合，包括培养、抗原测试和血清学。相比之下，使用PCR，例如多重PCR测定，可以在工作日内筛查单个呼吸道样本中的大量呼吸道病原体。此外，PCR方法具有许多其他优点：它高度灵敏和特异，获得结果的时间更短，劳动强度更低，并且能够鉴定生长缓慢或难以培养的病原体。因此，需要开发用于检测细菌性呼吸道病原体的更有效和更快速的方法，例如允许在单个测定中检测以下中的两种或更多种的方法：肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、卡他莫拉菌(卡他布兰汉菌)、脑膜炎奈瑟菌和肺炎克雷伯菌，以便有效地向患者提供适当的治疗。特别地，需要能够用更特异和包容性的基因标志物同时检测上文提及的呼吸道病原体的多重实时PCR方法。
[0012]概述
[0013]本文的公开内容包括检测样品中的肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌的方法。在一些实施方案中，方法包括：使所述样品与多于一对引物接触，其中多于一对引物包含：能够与肺炎链球菌的lytA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1
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10的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1
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10的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与肺炎链球菌的cpsA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:16
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25的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:16
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25的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与脑膜炎奈瑟菌的sodC基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:31
‑
39的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:31
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39的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与脑膜炎奈瑟菌的crtA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:45
‑
54的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:45
‑
54的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。方法可以包括：如果所述样品包含肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌中的一种或两种，则从所述样品产生肺炎链球菌的lytA基因序列的扩增子、肺炎链球菌的cpsA基因序列的扩增子、脑膜炎奈瑟菌的sodC基因序列的扩增子、脑膜炎奈瑟菌的crtA基因序列的扩增子或其任何组合。方法可以包括：确定一种或更多种扩增子的存在或量，作为所述样品中肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌中的一种或两种的存在的指示。方法可以包括：使样品与能够与添加到样品中的内部扩增对照(IAC)杂交的至少一对对照引物接触，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:60
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69和130
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132的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:60
‑
69和130
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132的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列，并从所述样品产生IAC的扩增子；并且确定IAC的扩增子的存在或量，作为用样品进行的测定的性能的指示。在一些实施方案中，样品与包含多于一对引物和能够与IAC杂交的至少一对对照引物的组合物接触。
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种检测样品中的肺炎链球菌(S.pneumoniae)和脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)的方法，所述方法包括：使所述样品与多于一对引物接触，其中所述多于一对引物包含：能够与肺炎链球菌的lytA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1
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10的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1
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10的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与肺炎链球菌的cpsA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:16
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25的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:16
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25的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与脑膜炎奈瑟菌的sodC基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:31
‑
39的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:31
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39的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与脑膜炎奈瑟菌的crtA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:45
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54的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:45
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54的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；如果所述样品包含肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌中的一种或两种，则从所述样品产生肺炎链球菌的lytA基因序列的扩增子、肺炎链球菌的cpsA基因序列的扩增子、脑膜炎奈瑟菌的sodC基因序列的扩增子、脑膜炎奈瑟菌的crtA基因序列的扩增子或其任何组合；并且确定一种或更多种扩增子的存在或量，作为所述样品中肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌中的一种或两种的存在的指示。2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括使所述样品与能够与添加到所述样品中的内部扩增对照(IAC)杂交的至少一对对照引物接触，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:60
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69和130
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132的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:60
‑
69和130
‑
132的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列，以及从所述样品产生所述IAC的扩增子；并且确定所述IAC的扩增子的存在或量，作为用所述样品进行的测定的性能的指示。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述样品与包含所述多于一对引物和能够与IAC杂交的所述至少一对对照引物的组合物接触。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述样品是生物样品或环境样品。5.根据权利要求4所述的方法，其中所述环境样品从以下获得：食品样品、饮料样品、纸张表面、织物表面、金属表面、木材表面、塑料表面、土壤样品、淡水样品、废水样品、盐水样品、暴露于环境空气或其他气体的样品、其培养物或其任何组合。6.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品从以下获得：组织样品、唾液、血液、血浆、血清、粪便、尿液、痰、黏液、淋巴、滑液、脑脊液、腹水、胸腔积液、血清肿、脓、皮肤或黏膜表面的拭子、其培养物或其任何组合。7.根据权利要求4所述的方法，其中所述生物样品包括血液样品、呼吸道样品和/或其培养物。8.根据权利要求1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述多于一对引物包含含有SEQ ID NO:1、3、5、7或9的序列的第一引物，含有SEQ ID NO:2、4、6、8或10的序列的第二引物，含有
SEQ ID NO:16、18、20、22或24的序列的第三引物，含有SEQ ID NO:17、19、21、23或25的序列的第四引物，含有SEQ ID NO:31、33、35、36或38的序列的第五引物，含有SEQ ID NO:32、34、37或39的序列的第六引物，含有SEQ ID NO:45、47、49、51或53的序列的第七引物，以及含有SEQ ID NO:46、48、50、52或54的序列的第八引物。9.根据权利要求1
‑
8中任一项所述的方法，其中所述多于一对引物包含含有SEQ ID NO:60、62、64、66、68或131的序列的第九引物，以及含有SEQ ID NO:61、63、65、67、69、130或132的序列的第十引物。10.根据权利要求1
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9中任一项所述的方法，其中能够与肺炎链球菌的lytA基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:1和2、SEQ ID NO:3和4、SEQ ID NO:5和6、SEQ ID NO:7和8，或SEQ ID NO:9和10；能够与肺炎链球菌的cpsA基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:16和17、SEQ ID NO:18和19、SEQ ID NO:20和21、SEQ ID NO:22和23，或SEQ ID NO:24和25；能够与脑膜炎奈瑟菌的sodC基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:31和32、SEQ ID NO:33和34、SEQ ID NO:35和32、SEQ ID NO:36和37，或SEQ ID NO:38和39；并且能够与脑膜炎奈瑟菌的crtA基因杂交的该对引物为SEQ ID NO:45和46、SEQ ID NO:47和48、SEQ ID NO:49和50、SEQ ID NO:51和52，或SEQ ID NO:53和54。11.根据权利要求1
‑
10中任一项所述的方法，其中能够与IAC杂交的该对对照引物为SEQ ID NO:60和61、SEQ ID NO:62和63、SEQ ID NO:64和65、SEQ ID NO:66和67、SEQ ID NO:68和69、SEQ ID NO:61和130，或SEQ ID NO:131和132。12.根据权利要求1
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11中任一项所述的方法，其中所述扩增使用选自由以下组成的组的方法进行：聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCR)、环介导的等温扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、复制酶介导的扩增、免疫扩增、基于核酸序列的扩增(NASBA)、自主序列复制(3SR)、滚环扩增和转录介导的扩增(TMA)。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述PCR是实时PCR。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述PCR是定量实时PCR(QRT
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PCR)。15.根据权利要求1
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14中任一项所述的方法，其中每种引物包含外源核苷酸序列。16.根据权利要求1
‑
15中任一项所述的方法，其中确定一种或更多种扩增子的存在或量包括使所述扩增子与多于一种寡核苷酸探针接触，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种包含选自由SEQ ID NO:11
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15、26
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30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:11
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15、26
‑
30、40
‑
44、55
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59、70
‑
74和133
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134组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种包含选自由SEQ ID NO:11
‑
15、26
‑
30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种由选自由SEQ ID NO:11
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15、26
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30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列组成。19.根据权利要求16
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18中任一项所述的方法，其中每种探针在5
’
末端和3
’
末端的侧翼为互补序列。20.根据权利要求19所述的方法，其中所述互补序列中的一个包含荧光发射物部分，并且另一个互补序列包含荧光猝灭物部分。
21.根据权利要求16
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18中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。22.一种组合物，所述组合物用于检测样品中的肺炎链球菌和脑膜炎奈瑟菌，包含：能够与肺炎链球菌的lytA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:1
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10的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:1
‑
10的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与肺炎链球菌的cpsA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:16
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25的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:16
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25的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与脑膜炎奈瑟菌的sodC基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:31
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39的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:31
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39的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；以及能够与脑膜炎奈瑟菌的crtA基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:45
‑
54的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:45
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54的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。23.根据权利要求22所述的组合物，所述组合物还包含能够与内部扩增对照(IAC)杂交的至少一对对照引物，其中所述至少一对对照引物中的每种引物包含SEQ ID NO:60
‑
69和130
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132的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:60
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69和130
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132的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列。24.根据权利要求22
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23中任一项所述的组合物，其中所述能够与肺炎链球菌的lytA基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:1、3、5、7或9的序列的引物和含有SEQ ID NO:2、4、6、8或10的序列的引物；所述能够与肺炎链球菌的cpsA基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:16、18、20、22或24的序列的引物和含有SEQ ID NO:17、19、21、23或25的序列的引物；所述能够与脑膜炎奈瑟菌的sodC基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:31、33、35、36或38的序列的引物和含有SEQ ID NO:32、34、37或39的序列的引物；并且所述能够与脑膜炎奈瑟菌的crtA基因杂交的至少一对引物包含含有SEQ ID NO:45、47、49、51或53的序列的引物和含有SEQ ID NO:46、48、50、52或54的序列的引物。25.根据权利要求23
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24中任一项所述的组合物，其中能够与IAC杂交的所述至少一对对照引物包含含有SEQ ID NO:60、62、64、66、68或131的序列的引物和含有SEQ ID NO:61、63、65、67、69、130或132的序列的引物。26.根据权利要求22
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25中任一项所述的组合物，所述组合物还包含多于一种寡核苷酸探针，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种包含选自由SEQ ID NO:11
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15、26
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30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列，或与选自由SEQ ID NO:11
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15、26
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30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列显示至少约85％同一性的序列。27.根据权利要求26所述的组合物，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种包含选自由SEQ ID NO:11
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15、26
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30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列。28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每种由选自由SEQ ID NO:11
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15、26
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30、40
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44、55
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59、70
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74和133
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134组成的组的序列组成。
29.根据权利要求26
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28中任一项所述的组合物，其中所述多于一种探针中的至少一种包含荧光发射物部分和荧光猝灭物部分。30.一种检测样品中的金黄色葡萄球菌(S.aureus)、流感嗜血杆菌(H.influenzae)、卡他莫拉菌(M.catarrhalis)和肺炎克雷伯菌(K.pneumoniae)的方法，所述方法包括：使所述样品与多于一对引物接触，其中所述多于一对引物包含：能够与金黄色葡萄球菌的nuc基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:75
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83的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:75
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83的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与流感嗜血杆菌的fucK基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:88
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95的序列中的任一个，或与SEQ ID NO:88
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95的序列中的任一个显示至少约85％同一性的序列；能够与卡他莫拉菌的copB基因杂交的至少一对引物，其中所述至少一对引物中的每种引物包含SEQ ID NO:101
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【专利技术属性】
技术研发人员：张秋凤，付满良，张传慧，
申请(专利权)人：贝克顿迪金森公司，
类型：发明
国别省市：