本发明专利技术公开了一种用于肾综合征出血热诊断的重组抗原及其快速金标诊断试纸条。其主要针对于ＨＦＲＳ诊断的截短ＮＰ重组抗原ｅ１１２及可同时检测ＨＦＲＳ病人血清中ＩｇＭ、ＩｇＧ抗体的ＨＦＲＳ快速金标诊断试纸条。利用基因克隆技术获得汉坦病毒的截短ＮＰ重组抗原，纯化后即可用于免疫学诊断。快速金标诊断试纸条克服了现有ＨＦＲＳ诊断方法的局限性，可同时检测ＨＦＲＳ病人血清中ＩｇＭ、ＩｇＧ抗体，可判断患者的感染状态，并对患者作出早期诊断，能够降低病死率，提高治愈率。此外，由于金标试纸条无需特殊仪器，无需训练有素的专业人员，可以满足基层医院、农村卫生院等临床检测的需要，而且大大的降低了成本，方便了患者，适用于大规模的血清流行病学调查。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疾病诊断的抗原，具体说是一种用于肾综合征出血热诊断的重组抗原及其快速金标诊断试纸条。
技术介绍
汉坦病毒(Hantaviruses，HV)流行范围广泛、危害严重，已成为一个全球性的公共卫生问题。由HV感染引起的肾综合征出血热(hemorrhagic fever withrenal syndrome，HFRS)是一组以发热、出血和肾脏损害为主要临床表现的急性传染病。疫区分布于亚洲、欧洲、非洲和美洲32个国家和地区，但主要流行于亚洲的我国和韩国，次为欧洲的俄罗斯、芬兰和前南斯拉夫等国，非洲和美洲的病例较少；疫源地则遍及世界五大洲70余个国家。在中国，HFRS是除病毒性肝炎之外危害最大的病毒性传染病，其发病人数占世界发病总数90％以上。1978年韩国学者李镐汪等率先成功地分离到HFRS的病原——HV，并建立了检测抗原和抗体的特异性免疫荧光技术，使HFRS防治的研究进入了一个新的阶段。在血清学检测和实验研究中，目前已经建立了一系列技术方法，如间接免疫荧光法(IFA)、免疫酶联吸附实验(ELISA)、血凝抑制试验(HI)、空斑减少中和试验(PRNT)等。但是，就实验室诊断而言，目前在国内应用最普遍的仍属IFA。IFA具有很好的敏感性和特异性，但需要荧光显微镜和训练有素的专业人员，难以在农村、基层医院及现场使用。总的来说，近年问世的各种HV基因、抗原和抗体的检测新技术尚不够稳定，有些方法较为复杂，操作流程长，难以在基层单位或工作现场应用；此外，国内HFRS检测试剂或药盒的标准化和商品化率还较低。因此，急需建立一种快速、简便、特异、敏感、稳定和规范的，并能满足不同需要的早期诊断方法。研究发现汉坦病毒核衣壳蛋白上含有属特异性、型特异性、组特异性和病毒株特异性抗原位点。N蛋白的N未端100aa(氨基酸)主要是亲水性的，具有免疫优势，存在交叉反应性的线性抗原表位。近年来随着分子生物学技术的发展，新的病毒学检测方法不断被应用于HFRS防治研究中，如应用重组HV核衣壳蛋白(NP)替代从细胞培养或乳鼠鼠脑制备的病毒抗原，具有安全、省时、易于纯化和标化等优点，而且汉坦病毒的核衣壳蛋白同源性最高，抗原性最保守，免疫原性强，且容易表达，患者对该蛋白的抗体应答产生早而且滴度高。因而，可以运用重组的NP抗原进行HFRS血清学诊断。胶体金是一种处于半还原状态的悬浮颗粒，能迅速吸附蛋白质等大分子而不影响其活性，胶体金具有易分辨的红至紫红色，在与大分子结合后，易于用肉眼识别，不需二级放大即可直接观察结果，胶体金诊断产品因而可直接进入没有复杂检测设备的诊所甚至家庭里。近年来，以早孕检测试纸为代表的胶体金免疫诊断试剂已进入千家万户，给人们的生活带来很大的方便。从包括中国专利等有关资料检索表明，目前尚未有利用基因工程方法获得高表达、高活性的截短NP重组抗原用于肾综合征出血热的诊断及可同时检测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体的HFRS金标快速诊断试纸条的相关报道。
技术实现思路
为了弥补现有技术的不足，本专利技术的目的是要提出一种用于HFRS诊断的截短NP重组抗原e112及可同时检测HFRS病人血清中IgM、IgG抗体的HFRS快速金标诊断试纸条。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是一.溶液配方(1)重组抗原溶解液SDS 0.1％甘氨酸 250mmol/LTris.Cl 25mmol/L(2)胶体金溶液0.03～0.05％的四氯金酸，加1～2％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒；(3)二抗羊抗人IgG单抗、羊抗人μ链单抗，羊抗鼠IgG单抗由厦门波生生物技术有限公司研制；(4)包被缓冲液含1～3％蔗糖的磷酸盐缓冲液；(5)基础缓冲液由厦门波生生物技术有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的缓冲液；(6)反应缓冲液含0.01～0.05％NaN3的磷酸盐缓冲液；(7)磷酸盐缓冲液(PBS)为在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4，用盐酸调节溶液的pH值至7.2～7.6，加水定容至1L。二.本专利技术重组抗原的工艺流程(1)本研究所用的汉坦病毒株A537是1985年在福建省周宁县HFRS疫区捕获的一黑线姬鼠肺组织中应用Vero E6细胞直接分离出汉坦病毒株A537；(2)以汉坦病毒株A537基因组为模板，以P14为逆转录引物、4S1/S2为PCR扩增引物，用逆转录PCR法常规扩增得到S基因全长片段，其大小为1696bp，用TA克隆技术将此大片段克隆入TA载体pMD 18-T中，获得重组质粒TA-A537；(3)以该重组质粒TA-A537为模板，以P1、P112为引物(p1为正向引物，添加了NcoI酶切位点；p112为反向引物，添加了Sal I酶切位点和终止密码子tta)，从中扩增出长度约330bp的截短片段p1-112，将此片段定向插入原核表达载体pET-30a，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达；Western blot证实该重组抗原e112能被HFRS患者阳性血清所识别，以上所用引物见表1；表1汉坦病毒克隆、表达所应用的引物 (4)克隆基因p1-112的核酸序列及其所编码的氨基酸序列1ATG GAG GAA CTG CAG AGG GAA ATC AAT GCC CAT GAG GGT CAA CTG 451Met Glu Glu Leu Gln Arg Glu Ile Asn Ala His Glu Gly Gln Leu 1546 GTG ATA GCC AGG CAG AAG GTG AGG GAT GCA GAA AAA CAA TAT GAA 9016 Val Ilc Ala Arg Gln Lys Val Arg Asp Ala Glu Lys Gln Tyr Glu 3091 AAG GAT CCA GAT GAG CTG AAT AAA AGA ACA TTA ACA GAC AGA GAA 13531 Lys Asp Pro Asp Glu Leu Asn Lys Arg Thr Leu Thr Asp Arg Glu 45 136 GGG GTT GCA GCA TCT ATC CAG GCC AAG ATT GAT GAA TTG AAA AGG 18046Gly Val Ala Ala Ser Ile Gln Ala Lys lle Asp Glu Leu Lys Arg60181 CAG TTA GCA GAT AGG ATT GCA ACC GGA AAG AAC CrT GGG AAA GAA 22561Gln Leu Ala Asp Arg Tle Ala Thr Gly Lys Asn Leu Gly Lys Glu 75226 CAG GAT CCC ACA GGG GTT GAG CCT GGA GAC CAT CTG AAA GAG AGA 27091Gln Asp Pro Thr Gly Val Glu Pro Gly Asp Hls Leu Lys Glu Arg 105271 TCA ATG CTT AGT TAT GG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一组肾综合征出血热快速金标诊断试纸条的溶液配方，其特征是： （１）重组抗原溶解液：ＳＤＳ ０．１％ 甘氨酸 ２５０ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ．Ｃ１ ２５ｍｍｏｌ／Ｌ （２）胶体金溶液：０．０３～０．０５％的四氯金酸，加１～２％柠檬酸三钠制备成胶体金颗粒； （３）二抗：羊抗人ＩｇＧ单抗、羊抗人μ链单抗，羊抗鼠ＩｇＧ单抗； （４）包被缓冲液：含１～３％蔗糖的磷酸盐缓冲液； （５）基础缓冲液：由厦门波生生物技术有限公司研制，主要含牛血清白蛋白的缓冲液； （６）反应缓冲液：０．０１～０．０５％ＮａＮ↓［３］的磷酸盐缓冲液； （７）磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ）：为在８００ｍｌ蒸馏水中溶解８ｇ ＮａＣｌ、０．２ｇ ＫＣｌ、１．４４ｇ Ｎａ↓［２］ＨＰＯ↓［４］和０．２４ｇ ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］，用盐酸调节溶液的ｐＨ值至７．２～７．６，加水定容至１Ｌ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：严延生，吴守丽，
申请(专利权)人：福建省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：35[中国|福建]
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