一种修饰胶原蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种对胶原蛋白的修饰方法。用化学方法将胶原蛋白氨基酸侧链上的羟基酯化，通过酯键可以在侧链上连接新的分子结构。这些分子结构带有至少一个参与酯键形成的酰基，并可同时带有氨基、巯基、羧基等可交联基团或其他功能基团。这些功能基团在被保护基保护的状态下不会受到酯化过程的影响，并在酯化反应完成后脱保护。通过酯化过程调节被修饰的羟基数量，以及调节分子结构的大小、立体构型和所携带的功能基团种类、数量，可以改变胶原蛋白的最大可交联程度、抗降解能力和力学性能，以及赋予胶原蛋白新的物理化学特性。本发明专利技术可用来制备目前以胶原蛋白为材料的各种组织工程产品和缝合线以及其他胶原基产品等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种对胶原蛋白进行修饰改性的方法，具体地说，涉及对胶原蛋白的氨基酸侧链进行化学修饰，以连接上新的功能基团，赋予胶原蛋白新的物理化学 特性。
技术介绍
胶原蛋白是人体组织的主要支撑结构，是人体的主要结构蛋白， 构成人体约30%的蛋白质。胶原蛋白含有大量的甘氨酸(31.4% -33.4% )、脯氨酸 (11.7% -13. 8% )、羟脯氨酸(9. 4% -12. 5% )，其最主要的特征是由三条α肽链缠绕形成 的三股螺旋结构，在三股螺旋结构区域有甘氨酰-脯氨酰_羟脯氨酰、甘氨酰-脯氨酰-Y、 甘氨酰-X-Y(X、Y代表除甘氨酰和脯氨酰、羟脯氨酰以外的任何氨基酸残基)这样一些三 肽的重复顺序存在。已报道的胶原蛋白有27种类型，并且可能还有尚未发现和报道的类 型，最常见的类型是I型、II型和III型，其中I型的生物体含量最为丰富，占全部胶原蛋白 含量的90%以上，在皮肤、肌腱、骨、血管等组织和器官中含量非常丰富，被广泛用作生物材 料。胶原蛋白具有抗原性低、与细胞亲和力大、可促进细胞生长、与血小板产生凝血作用等 特点。由于其优良的生物相容性，胶原蛋白堪称最合适的组织工程材料，但以天然胶原制作 的组织工程产品和缝合线等医疗植入物机械强度较低，力学性能较差，降解速率过快，不能 满足长期执行细胞支架功能的需要。为达到医学应用的要求，必须对胶原蛋白进行改性。目前对胶原蛋白进行改性的方法主要分为物理方法、化学方法以及与其它高分子 材料共混改性，也是目前胶原基材料制作中常用的方法。共混改性由于关系到其它高分子 材料的性能，并非本专利的关注点，在此不予讨论。物理方法即通过物理手段，如紫外线照 射、重度脱水、Y射线照射和热交联等方法对胶原蛋白进行改性，其缺点在于交联程度低且 不均勻，目前仅作为辅助手段来使用。而化学方法又可以具体分为化学试剂交联、侧链修饰和生理活性物的固定化三种 方法。生理活性物的固定化是指以胶原为支撑物，将各种生理活性物质固定化，在使用过程 中再释放出来发挥各自的生理作用。侧链修饰就是对胶原分子侧链上的功能基团进行化学 修饰，改善电荷分布，使胶原获得新的特性的方法，这方面的研究目前还较少，仅有对侧链 氨基和羧基的修饰研究。化学试剂交联法是使用最广泛的化学改性方法。化学交联剂从功 能上分为两类第一类是具有两个或多个官能团的交联剂，可以在相邻的两条肽链间形成 胺基桥键；另一类则可以活化谷氨酸或天东氨酸残基上的羧基，使之与另一条肽链上的氨 基反应形成酰胺键，从而形成交联。目前常用的化学交联剂有醛类(戊二醛、甲醛、乙二醛 等)、1，6_己二异氰酸酯(HDI)、碳化二亚胺(EDC)、叠氮磷酸二苯酯(DPPA)、乙酰叠氮、环 氧化物(包括单功能和多功能两大类)、京尼平、胼等。在这些交联剂中，碳化二亚胺、胼和 叠氮类化合物(包括DPPA、乙酰叠氮等)通过活化氨基酸残基上的羧基与氨基形成酰胺键 产生交联，而醛类、1，6_己二异氰酸酯、京尼平等都是通过与氨基反应形成胺基桥键形成交 联。环氧化物则在不同条件下既可与氨基反应，也可与羧基反应。交联可以提高胶原产品的机械强度和力学性能，并且降低胶原的酶降解速度和机 械强度的下降速度，而且这些作用随交联程度的提高而增强。这是由于交联的作用使酶无 法与胶原分子充分接触，酶的分解作用只能在胶原产品表面进行，因此减缓了胶原的分解速度和机械强度的下降速度。
技术实现思路
目前无论是化学交联还是侧链修饰，均是利用了胶原蛋白侧链上的氨 基和羧基。而对于侧链上含量更为丰富的羟基，由于其反应活性低于氨基和羧基，在适用于 胶原蛋白的温和反应条件下一般不起反应，因而目前还未得到利用。由于胶原蛋白含有独 特的羟脯氨酸和羟赖氨酸，这使得胶原蛋白侧链上的羟基不仅来源于丝氨酸、苏氨酸和酪 氨酸的残基，也来源于羟脯氨酸和羟赖氨酸的残基。胶原蛋白中羟脯氨酸含量很高，可以 达到9. 4% -12. 5%，这使得侧链上羟基的含量大大高于氨基和羧基的含量。以牛I型胶原 α -1链为例，其在三螺旋区的肽段长度为1014个氨基酸，含有89个由赖氨酸、精氨酸和组 氨酸残基提供的氨基和78个由天冬氨酸和谷氨酸残基提供的羧基，以及49个由丝氨酸和 苏氨酸残基提供的羟基。由于脯氨酸和羟脯氨酸主要存在于三螺旋区，所以按保守的估计 假定这一肽段中羟脯氨酸含量为10%计算，则含有101个羟脯氨酸残基，再加上49个丝氨 酸和苏氨酸残基，共可提供150个羟基，由于羟赖氨酸的含量很低，此处没有计算其含量。 可见如能将羟基转化为可交联位点，与目前的交联方法相比，可以显著提高胶原的交联程 度，从而在更高程度上提高胶原产品的机械强度和力学性能，以及降低胶原的酶降解速度 和机械强度的下降速度。本专利技术利用羟基的酯化作用，向羟基上连接新的分子结构。这个分子结构必须含有一个或一个以上的参与酯键形成的酰基，除此以外还可同时带有氨基、巯基、羧基等可用 来交联的功能团或其它功能团，用来提供交联位点或赋予胶原蛋白新的物理化学性能。常 见的酯化方法有酰卤法、酸酐法、活化酯法、叠氮法等。酰卤法是指用酰卤(指酰氟、酰氯、酰溴或酰碘)与羟基反应形成酯。由于酰卤很 活泼，该反应很容易进行。也正因为酰卤非常活泼，一般在使用前制备酰卤。参见实施例1。活化酯法即通过预先将羧基活化，形成不稳定的酯，再与胶原蛋白的羟基反应成 酯。可使用碳二亚胺类化合物，如N，N' -二异丙基碳二亚胺(DIC)、二环己基碳二亚胺 (DCC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)等，来活化羧基。参见实施例 2。叠氮法则是将羧基活化为酰基叠氮，再与胶原蛋白的侧链羟基反应成酯。如用 DPPA与羧基反应形成酰基叠氮，再与胶原的侧链羟基成酯。反应在二甲基甲酰胺溶液中进 行，过程类似于DPPA催化的胶原蛋白交联反应。在交联反应中，由于氨基比较活跃，因而羧 基与氨基形成酰胺键；而羟基相对不活跃，一般认为在交联条件下不形成酯键。叠氮法反应 速度很慢，如使用DPPA的交联反应需24小时，而用乙酰叠氮活化羧基则所需时间更长。酸酐法则是用酸酐与羟基反应成酯。如果使用二元酸的酸酐则可以在羟基的位置 上连接一个羧基。酸酐比酰卤稳定，不必临用前制备。参见实施例3。使用以上任一种方法可将一个分子结构通过酯键连接到胶原蛋白上。这个分子 结构除了带有形成酯键所需的一个或多个酰基外，还可以带有巯基、羧基、氨基等可交联基 团或其它功能基团。如果带有这些可交联基团或其它易受酯化过程影响的基团，必须先对 这些基团进行保护才可以进行酯化反应。常用的巯基保护基有对甲苯基、对甲氧苄基、三苯 甲基、二硫化物等，待酯化反应完成后用相应的方法脱保护，这样就可以在原先羟基的位置 产生可交联的巯基，这个巯基可以在氧化条件下在胶原蛋白的肽链间产生交联。羧基可以 用酸酐保护，如使用二元酸的酸酐，在成酯反应完成后，一个羧基与胶原蛋白的羟基形成酯键，另一个则处于活性状态，可参加其它反应。氨基的保护方法比较多，常用的氨基保护基 有芴甲氧羰酰基(缩写=Fmoc)、叔丁氧羰基(缩写t-Boc)、苄氧羰基(缩写CBz)、2_联 苯基-2-丙氧羰基(缩写BPoc)、三氟乙酰基(trifluoroacetyl)等，可根据保护和脱保护 的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种修饰胶原蛋白的方法，即对胶原蛋白的氨基酸侧链上的羟基进行酯化修饰，以连接上新的分子结构，而这个分子结构可以带有不同的功能基团，赋予胶原蛋白不同的物理化学性能。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：颜建华，
申请(专利权)人：颜建华，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]